pET 系統概述

pET 系統是在大腸桿菌中克隆和表達重組蛋白的zui強大系統。根據zui初由 Studier 等開發的 T7 啟動子驅動系統， Novagen 的 pET 系統已用于表達成千上萬種不同蛋白。

控制基礎表達水平

pET 系統提供 6 種載體 - 宿主菌組合，能夠調節基礎表達水平以優化目標基因的表達。沒有單一策略或條件適用于所有目標蛋白，所以進行優化選擇是必要的。

宿主菌株

質粒在非表達宿主菌中構建完成后，通常轉化到一個帶有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（ λ DE3 溶原菌）中表達目標蛋白。在 λ DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 啟動子控制。未誘導時便有一定程度轉錄，因此適合于表達其產物對宿主細胞生長無毒害作用的一些基因。而宿主菌帶有 pLysS 和 pLyE 時調控會更嚴緊。 pLys 質粒編碼 T7 ，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未誘導細胞中轉錄目標基因的能力。 pLysS 宿主菌產生低量 T7 ，而 pLysE 宿主菌產生更多酶，因此是zui嚴緊控制的 λ DE3 溶原菌。

有 11 種不同DE3 溶原化宿主菌。使用zui廣泛的為 BL21 及其衍生菌株，它的優點在于缺失 lon 和 ompT 蛋白酶。 B834 菌株為營養缺陷型，因此可用 35 S- 和硒代對目標蛋白進行高特異活性標記。 BLR 為 recA - 衍生菌株，改善了質粒單體產量，有助于穩定含有重復序列的目標質粒。兩個硫氧還蛋白還原酶 （ trxB ） 突變菌株 （AD494,BL21 trxB ） ，有利于大腸桿菌胞漿中二硫鍵形成。 Origami TM 和 OrigamiB 菌株為 trxB/gor 雙突變，這兩個酶是主要還原途徑的關鍵酶。 Origami 和 OrigamiB 宿主菌的主要優點是能形成正確折迭的含有二硫鍵的蛋白。新的 Rosetta TM 菌株補充了四種大腸桿菌稀有密碼子的 tRNA ，改善了由于密碼子使用頻率不同而引起的一些真核蛋白低表達。其它菌株背景包括 K-12 菌株 HMS174 和 NovaBlue ，象 BLR 一樣為 recA - 。這些菌株可穩定表達其產物可能導致 DE3 噬菌體丟失的某些目標基因。由于存在 F 附加體編碼的高親和力 lacIq 阻遏蛋白， NovaBlue 為一個有用的嚴緊型宿主菌。此外， Novagen 提供了 λ DE3 溶原化試劑盒，用于制備其它遺傳背景的新表達宿主菌。表達高毒性基因或制備新的 λ DE3 溶原菌的另一替代方法是通過 l CE6 感染提供 T7 RNA 聚合酶。雖然不如用 IPTG 誘導 λ DE3 溶原菌方便，這種策略也被優先用于一些應用中。

高嚴緊性 T7 lac 啟動子

除了在宿主菌水平選擇三種基本的表達嚴緊性， pET 系統中 T7 啟動子本身提供了兩種不同的嚴緊性選擇：普通 T7 啟動子和 T7 lac 啟動子。 T7 lac 啟動子在啟動子區下游 17bp 處含有一個 25bp 的 lac 操縱序列。該位點結合 lac 阻遏蛋白能夠有效降低 T7 RNA 聚合酶的轉錄，這樣提供了在 λ DE3 溶原菌中抑制基礎表達的第二種基于 lacI 的機制（除了抑制 lacUV5 ）。含 T7 lac 啟動子的 pET 質粒還具有它們自己的 lacI ，確保足夠的阻遏蛋白結合到操縱基因位點上。

在實際應用中，為了獲得zui高產量的蛋白，通常應該測試多種不同的載體 / 宿主菌組合。

控制誘導的表達水平

在許多情況下，表達活性可溶性的蛋白依賴于宿主細胞的背景、培養條件和合適的載體配置。通常，目標蛋白活性zui高的條件與產量zui高的條件不一致。除了根據載體 / 宿主菌組合控制 T7 RNA 聚合酶的基礎表達提供不同嚴緊性， pET 系統還根據誘導物（ IPTG ）濃度，對目標蛋白表達提供了真正的“變阻器”控制。 Tuner 和 OrigamiB 宿主菌的 lacY 突變使這種控制成為可能。

選擇 pET 載體

所有的 pET 載體均來自 pBR322 ，但彼此間先導序列、表達信號、融合標簽、相關限制性位點和其它特點有所不同。有兩大類 pET 質粒，即轉錄載體和翻譯載體：

轉錄載體（包括 pET-21 、 pET-23 和 pET-24 ）表達目標 RNA ，但不提供翻譯信號。它們用于從自身帶有細菌翻譯信號的目標基因表達蛋白。（注意：轉錄載體通過命名后面的一個缺失字母后綴加以區分）

翻譯載體含有設計用于蛋白表達的有效翻譯起始信號。許多載體在讀碼框 a 、 b 和 c 中帶有克隆位點，分別對應于 BamH I 位點的 GGA 、 GAT 和 ATC 三聯體。

選擇要點

選擇用于表達的 pET 載體通常涉及多種因素。考慮以下三個主要因素：

· 所表達蛋白的用途

· 所表達蛋白的已知信息

· 克隆策略

pET 載體表達的蛋白用途各種各樣。例如，表達量為分析級的蛋白可用于活性研究、突變體篩選和定性、篩選配體相互作用和抗原制備。大量活性蛋白用于結構研究、試劑或親和基質制備。許多載體適合表達用于篩選或抗原制備的分析量蛋白，然而只有載體、宿主菌和培養條件組合十分適宜才可能用于大量純化。如果需要活性蛋白連續高產，應該試驗多種載體、宿主菌和培養條件組合以找到*化結果。

任何關于目標蛋白的已知信息都有助于載體選擇。例如，一些蛋白的活性要求一個或兩個末端沒有外源序列。許多 pET 載體能夠克隆非融合序列，然而如果特定翻譯起始序列不能在大腸桿菌中有效利用，表達水平可能受影響。在這些情況下，常可用有效表達的氨基末端序列構建融合蛋白，然后在純化后用位點特異性蛋白酶消化去除融合序列。 LIC （連接非依賴的克隆）策略對這種方法特別有用，因為克隆操作通過腸激酶和因子 Xa 能夠去除所有氨基端載體編碼序列。

由于限制性位點和讀碼框相容性的需要，克隆策略也會影響載體選擇。由于許多 pET 載體具有共同的限制性位點配置，通常可能將一次制備的目標基因克隆到幾個載體中。采 PCR 克隆策略時則有不同的考慮。 LIC 載體試劑盒用于此目的，可通過 PCR 制備插入片段，而不需要限制性消化載體或插入片段。

溶解性和細胞定位

考慮了目標蛋白的應用和克隆策略，還應該確定目標蛋白的細胞定位和溶解性，這一點十分重要。在許多實際應用中常希望表達可溶的活性蛋白。

特定目標蛋白的溶解性取決于多種因素，包括各自的蛋白序列。在許多情況下，溶解性不是有或無的現象，載體、宿主菌和培養條件可被用來增加或減少獲得的可溶或不可溶形式的比例。 PET-32 載體系列使目標序列與通常能夠增加可溶性蛋白比例的硫氧還蛋白 （Trx.Tag ） 融合。新推出的 pET-43.1 系列具有通過大量系統篩選而得到的一種過量表達時具有*溶解性的大腸桿菌蛋白 --Nus.Tag 融合伴侶，從而進一步提高了目標蛋白的可溶性。此外， trxB 突變株 AD494 和 BL21 trxB ，或 trxB/gor OrigamiTM 和 OrigamiB 菌株可用于在胞漿中形成許多真核蛋白正確折迭和活性所要求的二硫鍵。低溫誘導（ 15 -25 ° C ）也可增加可溶性目標蛋白的比例。

獲得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周質中，為折迭和二硫鍵形成有更適宜的環境。為了達到這一目的，通常使用帶信號肽的載體。

一些純化策略可以優化胞質中不溶性包涵體的產量。抽提包涵體并溶解，然后目標蛋白在體外重新折迭 （ 如使用 Novagen 的蛋白折迭試劑盒 ） 。該過程通常產生高產量初始蛋白并防止宿主細胞中的蛋白降解。然而，重新折迭成活性蛋白的效率隨不同蛋白變化很大，可能相當低。 pET-31b （ + ）載體專為產生不可溶融合蛋白而設計，提供了生產小蛋白和多肽的有效方法。

滿足不同需要的融合標簽

如果融合序列不影響應用，生產帶有 S.Tag 、 T7.Tag a 、 His.Tag a 和 HSV.Tag a 的融合蛋白會很方便后續操作，并易于通過蛋白雜交檢測。這些多肽（融合序列很小），它們的檢測試劑極特異和靈敏。通過使用相應樹脂和緩沖液試劑盒， GST.Tag 、 S.Tag 和 T7.Tag 序列可用于親和純化。

使用 S.Tag 和 GST.Tag 分析試劑盒可對粗提或純化的融合蛋白準確定量。采用一種新穎底物的 FRETWorks S.Tag 分析試劑盒可通過熒光檢測到少于 1fmol 的融合蛋白。

His.Tag a 序列作為純化蛋白的融合伴侶非常有用，尤其對那些以包涵體形式表達的蛋白來說，它可以使親和純化可在溶解蛋白的*變性條件下進行。

CBD.Tag a 在低費用親和純化中非常有用。它們也特別適用于重新折迭（特別是帶有 CBD clos .Tag a 序列的 pET-34b （ + ）和 35b （ + ））。因為只有正確重新折迭的 CBDs 結合到纖維素基質上， CBIND 親和純化步驟能夠從制備物中去除不正確折迭的分子。任何標簽可用于固定目標蛋白，但由于 CBD.Tag 序列的低非特異性結合以及與纖維素基質的生物相容性，使它更適合用于這一目的。

Nus.Tag 、 Trx.Tag 和 GST.Tag 序列用來增加其融合伴侶的溶解性。 Nus.Tag 和 Trx.Tag 載體與利于在胞漿中形成二硫鍵的 Origami 宿主菌相容。

各種融合標簽和相應 pET 載體見列表。一些 pET 載體帶有數個***的融合標簽，作為 5' 融合伴侶。此外，許多載體通過目標基因序列符合讀碼框的通讀而表達末端帶有不同多肽標簽的融合蛋白。使用在 5' 標簽和目標序列之間含有蛋白酶切割位點（、因子 Xa 和腸激酶）的載體，可以在純化后選擇性去除一個或多個標簽。 pET-30 Ek/LIC 、 pET-32 Ek/LIC 、 pET-34 Ek/LIC 和 pET-36 Ek/LIC 是細胞定位和親和標簽配置良好的代表。 pET Ek/LIC 載體 Combo 試劑盒包括所有 4 種即用型載體，可直接用于構建數種目標基因構型。

pET NusA 融合系統 43.1

在大腸桿菌中生產可溶性活性蛋白

新推出的 pET NusA 融合系統設計用于克隆和高水平表達與 49a NusA （ Nus.Tag ）蛋白融合的多肽序列。對數據庫中 4000 個以上蛋白進行可溶性建模， NusA 蛋白被確認為具有zui高的可溶性。在用四種不同 NusA 融合蛋白進行的試驗中，大于 85% 的表達蛋白都是可溶的。 pET-43.1 載體含有 Nus.Tag 融合伴侶并與 trx/gor 突變體 Origami 和 OrigamiB 菌株相容，有利于在胞漿中形成二硫鍵。使用 pET-43.1 載體和這些 trx/gor 宿主菌組合可能獲得二硫鍵結合的蛋白。

優點

· 高可溶性的 N- 末端 Nus.Tag 融合伴侶

· 上游 His.Tag a 、 S.Tag 和可選擇的 C- 末端 HSV.Tag a 、 His.Tag 融合標簽

· 和腸激酶切割位點

· 多克隆位點位于所有讀碼框中

· 與 AD494 和 Origami 宿主菌株相容，可促進表達蛋白的正確折迭

pET 宿主菌株感受態細胞

所有 pET 系統宿主菌以預測試的感受態細胞形式提供，可立即用于轉化。

（ DE3 ）指宿主為 λ DE3 溶原菌，其染色體上帶有一拷貝由 lacUV5 啟動子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。這類菌株適用于從克隆到 pET 載體的目標基因生產蛋白。命名為 pLysS 和 pLysE 的宿主菌帶有編碼 T7 （為 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性質粒。帶有 pLysS 的細胞產生少量，而 pLysE 宿主菌產生更大量酶。這些菌株用于在誘導前抑制 T7 RNA 聚合酶的基礎表達，這樣可以穩定編碼影響細胞生長和活力的目標蛋白的 pET 重組體。帶有 pLacI 的宿主菌產生額外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 載體基礎表達的 lac 阻遏蛋白。 λ DE3 溶原化試劑盒用于制備其它遺傳背景的新表達宿主菌。

AD494 菌株為硫氧還蛋白還原酶 （ trxB ） 突變菌株，能夠在胞漿內形成二硫鍵，提供了生產正確折迭的活性蛋白的潛力。 TrxB 突變可用選擇，因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標記 bla 的質粒。

B834 為 BL21 的親本菌株。這些蛋白酶缺陷宿主菌為營養缺陷型，可用 35 S- 和硒代對目標蛋白進行高特異活性標記，從而用于結晶學研究。

BL21 應用zui廣的宿主菌來源，具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的優點。

BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有與 AD494 菌株相同的硫氧還蛋白還原酶突變 （ trxB ） 。由于 trxB 宿主有利于胞漿內二硫鍵形成，它們的使用可增加正確折迭的蛋白組分。 TrxB 突變可用選擇，因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標記 bla 的質粒。

BLR 為 BL21 的 recA - 衍生菌株，能夠改善質粒單體產量，有助于穩定含有重復序列或其產物能夠引起 DE3 噬菌體丟失的目標質粒。

HMS174 菌株在 K-12 背景上提供了 recA 突變。與 BLR 一樣，這些菌株能夠穩定其產物能夠引起 DE3 噬菌體丟失的某些目標基因。

NovaBlue 適合 用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株，具有高轉化效率、藍 / 白斑篩選能力（與合適質粒）和導致質粒 DNA 高產的 recA endA 突變。由于存在 F 附加體編碼的 lacI q 阻遏蛋白， NovaBlue 的 DE3 溶原菌是一個非常有用的嚴緊型宿主菌。

Origami 為 K-12 衍生的宿主菌，硫氧還蛋白還原酶突變 （ trxB ） 和還原酶 （ gor ） 基因均為突變，能夠大大增強胞漿內二硫鍵的形成。研究表明即使總體表達水平相似， Origami （ DE3 ）表達的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。 Origami 宿主菌與氨芐抗性質粒相容，可用于 pET-32 載體，硫氧還蛋白標簽能夠進一步增強在胞漿內形成二硫鍵。 TrxB 和 gor 突變可分別用和四環素選擇，因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標記 bla 的 pET 質粒。

Origami B 宿主菌來源于 BL21 lacZY 突變株，還帶有與原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突變。 Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的優點于一體。 TrxB 和 gor 突變可分別用和四環素選擇，因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標記 bla 的 pET 質粒。

Rosetta 宿主菌從 BL21 衍生而來，可增強帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白的表達。該菌株通過一個相容性抗性質粒補充密碼子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。這樣 Rosetta 菌株提供了“”的翻譯，從而避免因大腸桿菌密碼子使用頻率導致的表達限制。 tRNA 基因由它們的天然啟動子驅動。在 Rosetta （ DE3 ） pLysS 和 Rosetta （ DE3 ） pLacI 中，稀有 tRNA 基因存在于分別帶有 T7 和 lac 阻遏基因的同一質粒上。

Tuner 菌株為 BL21 的 lacZY 缺失突變株，能夠調整培養物中所有細胞的蛋白表達水平。 lac 通透酶（ lacY ）突變使得 IPTG 均勻進入群體所有細胞，從而具有濃度依賴、水平均一的誘導表達。通過調整 IPTG 濃度，表達可從極低水平調節到*、*誘導的表達水平（通常與 pET 載體相關）。低水平表達有時可能增強難表達蛋白的溶解性和活性。 Tuner （ DE3 ） pLacI 菌株與 pETBlue 和 pTriEx 載體的表達相容。

建議兄弟首先學習本版以前的帖子。

搬出老帖子，我們共同學習一下：

eeflying

：原核表達系統中，哪種載體 ?

原核表達沒有，可以說一般都是在碰，

和你要表達蛋白的性質有關，也和你表達后的用途，及因此而選擇的表達策略有關。

比如，

1。你是否介意有親和標簽，親和純化當然純化相對容易，但有時親和標簽的存在會影響蛋白的功能，

2。如果用親和標簽，用什么親和純化策略，his 或GSH還是染料抑或是IgG-ProteinA親和，LAB的IMPAC-TWIN,還是別的如轉鐵蛋白等，親和層析的策略也有很多，

3。zui終產物是否有必要將親和標簽去掉，如用蛋白酶切掉標簽，或 IMPAC-TWIN會自己切掉，用因子X切掉HIS,

4。表達的部位，是可溶性表達還是包涵體表達，是周質表達還是分泌表達還是分泌表達。

5。是否加入開關誘導、或是加入IPTG誘導噬菌體T7系統。

6。你表達的蛋白質是否會與細菌內某些蛋白相互作用而致表達失敗。

7。如果不用親和標簽，純化用什么方法純化?

8。即使都考慮全了，表達也未必成功，換載體是很常見的是。

9。載體選好后，表達條件的優化，如培養溫度，培養時間，IPTG濃度 等，我們一般在這部用正交設計或析因設計決定。

10。蛋白純化條件的優化，用均勻設計或球面設計或正交設計作曲線擬合，通過導數求極值的方法優化蛋白純化條件。

這些問題是相互關聯的，在實踐中可得有一段時間去摸索了。

YONG

:原核表達系統中，哪種載體 ?

載體沒有，看哪一種zui合適你的實驗目的。

這幾年新發展的載體一般具有下列特點的一個或多個：

1）更多的融合標簽選擇（提供多種親和純化方便）

2）嚴緊的表達調控，更低的滲漏表達

3）分子伴侶蛋白，促進折疊和可溶性表達

此外，具有更好的質粒穩定性并能夠糾正遺傳密碼偏愛的新的蛋白酶缺陷的宿主細胞也是一個很好的工具。

的不一定是的，pBV220經常可以給出不錯的表達，雖然多半是包含體。

YONG

:關于表達載體

不同的載體的特點不同，主要的差別有啟動子類型，質粒拷貝數等，基因本身的因素基因5’非編碼區的二極結構，密碼子的偏愛性等，宿主菌的特點也很重要（BL21是蛋白酶缺陷的菌株），融合表達策略也有利于順利表達外源蛋白。這些就決定了對某一個特定的基因而言，并非所有的表達載體都適合。現在還沒有誰可以用大腸桿菌成功表達每一個基因，尤其是使用的表達系統更是不可能。根據研究的目的以及基因和載體的特點選擇表達系統，說說容易，做起來很難。

SDS-PAGE所顯示的不表達很多情況下是低表達，尤其是當目的蛋白遷移率與菌體中某種豐富蛋白一致時，不高的表達帶常被遮蓋。Western blotting的靈敏度高，可以用來檢測很低的表達。

對于某些研究來說，表達是為了在細胞內提供某種功能，不需要高表達;更多的情況是把大腸桿菌作為制備重組蛋白的細胞工廠，此時表達量具有重要意義，低表達為蛋白純化帶來困難，對于某些研究或開發來說，低表達意義不大。 當然，通過western blotting檢測可以排除一些基因表達中的不確定或待確定因素，而且某些時候即使是高表達，western blotting也是蛋白定性的重要指標。

YONG

:請教-pET表達

我試著說一下：

1）如何獲得非融合表達?

的非融合表達很多情況下是大腸桿菌表達zui愿意看到的結果，如果是可溶性的，可能會讓大部分研究者更加興奮。但理想和現實是有差距的。憑心而論，你做的還是不錯的，畢竟看到了表達，雖然是包含體，雖然信號肽的切割情況不明，畢竟你可以拿到東西了。可以試一下包含體的復性和純化，測測活吧!否定一個信心苦苦得出的結果要慎重呀!

下面討論一下如何實現更高的追求：

首先是老生長談，影響大腸桿菌表達的因素：

遺傳密碼偏愛性、mRNA5'二級結構、第二密碼子等，參見各種綜述和論壇中的帖子。

融合表達優化了上述影響表達的因素，所以更容易成功。很多藥用蛋白的表達也采用了融合表達策略，可能是無奈的選擇，也可能是為了獲得可溶性表達或為了獲得有利于初步純化的性質并成功的解決了酶切或化學切割融合頭后目的蛋白的純化。IL-11就是這樣的例子。所以非融合表達并不是一無是處，關鍵看有沒有辦法達到zui后的目的。如果是藥用蛋白，準備申報臨床，保持天然的N-末端，所以蛋白酶或化學切割要非常特異，不要再N端引入新的氨基酸或導致目的蛋白N端不整齊。

非融合表達的N端的Met一般是報批容許的，雖然這不是天然的形式。非融合表達省略了切割融合頭的步驟和切割后的純化步驟，具有成本優勢。非融合表達的實現首先需要分析，其次看運氣，有時運氣因素更多。盡可能把影響基因表達的因素都考慮到并逐個優化要花費很大的精力，但這并不能保證這種優化一定會得到理想的結果，未知的因素和因素之間的作用使得的優化方案非常難實現，而且基因本身的因素也不允許隨心所欲的優化（比如氨基酸序列不能任意改變）。原核表達的特點就是時間短、花錢少，所以多方案的嘗試和理性的分析結合是大多數研究者采用的基本策略。具體到你的實驗來說，如果你是要做藥用蛋白，在融合表達成功后可以a.純化一點蛋白，看看N-末端;b.在你的融合頭后面引入一個切割位點，切割后產生天然N-末端。選擇策略看你們實驗室的傳統，怎么方便怎么做。有的實驗室純化能力強，有得上游強。不管如何，建立有效的測活方法很關鍵，這可以為表達策略和純化策略提供指引。

至于可溶性表達，看情況吧!如果你的包含體復性很成功，不必強求可溶性。降低誘導溫度，降低菌生長速度和基因表達速度，降低總表達量，把蛋白導入周質空間和使用具有分子伴侶功能的融合等策略有助于實現可溶性表達，但都沒有把握。如果你的蛋白的二硫鍵非常多，可溶性表達難度會較大。這些一般的原則很多綜述或研究論文都有不同角度的表述，關鍵是結合自己的研究目的和實驗室的條件靈活運用。

2）基因往表達載體中克隆失敗。可能是克隆的操作問題，也可能是這種表達方式導致的表達對細胞生長有不利影響或重組后的質粒不穩定。

驗證克隆操作可以通過載體自連對照解決，如果載體自連后的轉化子沒有或很少，說明酶切操作沒有問題。

如果表達產物對細胞有毒或質粒不穩定就不容易解決了，也許憑經驗可以判斷原因，但更換載體、宿主或表達方式可能是zui常用的方法。

YONG

:淺論基因表達系統的選擇

因表達是基因工程的重要內容，是工業、醫療和基礎研究領域的重要技術。

基因表達系統按照基因表達宿主的性質分為原核表達系統和真核表達系統兩類，前者主要包括大腸桿菌表達系統和枯草桿菌表達系統等，后者主要包括酵母表達系統、絲狀真菌表達系統和哺乳動物細胞表達系統等。

原核表達系統以大腸桿菌表達系統為代表，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高和表達產物分離純化相對簡單等優點，缺點主要是蛋白質翻譯后加工機制的缺乏，如二硫鍵的形成、蛋白糖基化和正確折疊。

簡單單細胞真核生物表達系統以酵母表達系統為代表，其中甲醇酵母具有較大優勢（主要包括畢赤酵母Pichia pastoris和漢森酵母Hansenula ploymorpha）。甲醇酵母表達系統主要優點有：表達量高，表達可誘導，糖基化機制接近高等真核生物，分泌蛋白易純化，容易實現高密發酵等。缺點是并非所有基因都可以獲得高表達，當然，這是幾乎所有表達系統的共同問題。

哺乳動物細胞表達系統主要優點是蛋白翻譯后加工機制zui接近體內的天然形式，缺點是表達量通常較低，生產成本高。

表達系統選擇的根據是研究和開發的目的。具體考慮以下幾個方面：

目的基因的來源，如果是大腸桿菌來源的基因，選擇大腸桿菌作為表達系統較好，這主要是考慮到與目的基因來源相同的宿主對于保證蛋白的活性較有利且基因遺傳密碼的偏愛性較一致。

生產的成本和工藝放大要求。大腸桿菌和畢赤酵母系統生產重組蛋白的成本低，生產工藝較簡單，用于規模化生產較有利。如果是研究需要小量蛋白，主要考慮目的蛋白的活性和小規模純化制備的方便。

研究周期和可操作性。在這一點上，大腸桿菌優于酵母，酵母優于細胞。

蛋白的用途和用量。對于藥品開發，這三種宿主都可以選擇，但要考慮到報批的要求。如果是體內用，天然的氨基酸序列較重要，不要因為基因表達和蛋白純化的便利引入融合伴侶，如果是制備抗原用于純化和體外的活性研究則不必太嚴格。某些蛋白體內活性需要的劑量并不大，如angiostatin，但是，大腸桿菌或酵母表達的蛋白體內半衰期短，所以蛋白用量較大。

蛋白的天然性質。如果目的蛋白本身是分泌蛋白，則選擇分泌表達較好，畢赤酵母分泌表達優勢非常顯著。對于大腸桿菌系統來說，其蛋白的分泌機制復雜，除了信號肽之外，有些蛋白的分泌和與成熟蛋白的序列有關，而且大腸桿菌的分泌很難進入培養基，通常是在周質空間積累。根據蛋白活性的要求，結合其天然的性質，選擇表達系統是非常重要的。

知識產權的考慮。如果是研究工作，選擇商品化的載體較好，因為同行對這些載體也很了解，對于用這些載體做出來的結果容易比較。如果是開發工作，選擇表達系統時是把載體的知識產權問題考慮進去，否則可能會受制于人。

總之，選擇一種合適的表達系統是開始基因表達工作前的重要步驟，選擇的主要依據是研究的目的，結合各種其他參數的綜合考慮。這種選擇可以充分體現出研究者智慧和風格。

YONG

:尋找載體

1）pThioHisA,B,C

Trc 啟動子，Thioredoxin融合，IPTG誘導，也可以用NdeI進行非融合表達

www.invitrogen.com

2）pBV220

PLPR***啟動子，42度熱誘導，EcoRI克隆，非融合表達。

病毒所張智清、候云德等構建，國內很多實驗室有。

3）pET系列

T7啟動子，IPTG誘導，一般為融合表達，NdeI或NcoI非融合表達

www.novagen.com

4）pQE系列載體

T5啟動子,IPTG誘導，融合表達

www.qiagen.com

原核表達載體種類非常多，下表不一定全

Features of E.coli Expression Vectors

Vector Name Promoter Selection marker Tag or Fusion Partener Protease Cleavage Replicon Provider

pALTER-Ex1 T7 Tet none none Promega

pALTER-Ex2 T7 Tet none none Promega

pBAD/His araBAD Amp N-His EK pUC Invitrogen

pBAD/Myc-His araBAD Amp C-His none pUC Invitrogen

pBAD/gIII araBAD Amp C-His none ColE1 Invitrogen

pCal-n T7-lac Amp N-CBP Thr ColE1 Stratagene

pCal-n-EK T7-lac Amp N-CBP Thr，EK ColE1 Stratagene

pCal-c T7-lac Amp C-CBP Thr ColE1 Stratagene

pCal-Kc T7-lac Amp C-CBP Thr ColE1 Stratagene

pcDNA 2.1 T7 Amp none none pUC Invitrogen

pDUAL T7-lac Kan C-CBP Thr ColE1 Stratagene

pET-3a-c T7 Amp none none pBR322 Novagen

pET-9a-d T7 Kan none none pBR322 Novagen

pET-11a-d T7-lac Amp none none pBR322 Novagen

pET-12a-c T7 Amp none none pBR322 Novagen

pET-14b T7 Amp N-His Thr pBR322 Novagen

pET-15b T7-lac Amp N-His Thr pBR322 Novagen

pET-16b T7-lac Amp N-His Xa pBR322 Novagen

pET-17b T7 Amp none none pBR322 Novagen

pET-19b T7-lac Amp N-His EK pBR322 Novagen

pET-20b（+） T7 Amp signal sequence C-His none pBR322 Novagen

pET-21a-d（+） T7-lac Amp C-His none pBR322 Novagen

pET-22b（+） T7-lac Amp signal sequence C-His none pBR322 Novagen

pET-23a-d（+） T7 Amp C-His none pBR322 Novagen

pET-24a-d（+） T7-lac Kan C-His none pBR322 Novagen

pET-25b（+） T7-lac Amp signal sequence C-His none pBR322 Novagen

pET-26b（+） T7-lac Kan Signal sequence C-His none pBR322 Novagen

pET-27b（+） T7-lac Kan signal sequence C-His none pBR322 Novagen

pET-28a-c（+） T7-lac Kan N-His C-His Thr pBR322 Novagen

pET-29a-c（+） T7-lac Kan C-His Thr pBR322 Novagen

pET-30a-c（+） T7-lac Kan N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-31b（+） T7-lac Amp C-His none pBR322 Novagen

pET-32a-c（+） T7-lac Amp internal His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-33b（+） T7-lac Kan internal His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-34b（+） T7-lac Kan N-CBDclos C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-35b（+） T7-lac Kan N-CBDclos C-His Thr Xa pBR322 Novagen

pET-36b（+） T7-lac Kan signal sequence N-CBDcenA C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-37b（+） T7-lac Kan signal sequence N-CBDcenA C-His Thr Xa pBR322 Novagen

pET-38b（+） T7-lac Kan signal sequence C-CBDcex C-His Thr pBR322 Novagen

pET-39b（+） T7-lac Kan （signal sequence） DsbA N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-40b（+） T7-lac Kan （signal sequence） DsbC N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-41a-c（+） T7-lac Kan GST N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-42a-c（+） T7-lac Kan GST N-His C-His Thr Xa pBR322 Novagen

pET-43a-c（+） T7-lac Kan NusA C-His N-His Thr EK pBR322 Novagen

pETBlue-1 T7-lac Amp C-His none pUC Novagen

pETBlue-2 T7-lac Amp C-His none pUC Novagen

pETBlue-3 T7-lac Amp N-His C-His Thr EK pUC Novagen

pGEMEX-1 T7 Amp T7 gene 10 none Promega

pGEMEX-2 T7 Amp T7 gene 10 none Promega

pGEX-1lT tac Amp GST Thr pBR322 Pharmacia

pGEX-2T tac Amp GST Thr pBR322 Pharmacia

pGEX-2TK tac Amp GST Thr EK pBR322 Pharmacia

pGEX-3X tac Amp GST Xa pBR322 Pharmacia

pGEX-4T tac Amp GST Thr pBR322 Pharmacia

pGEX-5X tac Amp GST Xa pBR322 Pharmacia

pGEX-6P tac Amp GST Pre pBR322 Pharmacia

pHAT10/11/12 lac Amp N-HAT EK pUC Clontech

pHAT20 lac Amp N-HAT EK pUC Clontech

pHAT-GFPuv lac Amp N-GFPuv EK pUC Clontech

pKK223-3 tac Amp none none pBR322 Pharmacia

pLEX PL Amp none none pUC Invitrogen

pMAL-c2X tac Amp N-MBP Xa ColE1 NEB

pMAL-c2E tac Amp N-MBP EK ColE1 NEB

pMAL-c2G tac Amp N-MBP Gen ColE1 NEB

pMAL-p2X tac Amp N-MBP Xa ColE1 NEB

pMAL-p2E tac Amp N-MBP EK ColE1 NEB

pMAL-p2G tac Amp N-MBP Gen ColE1 NEB

pProEX HT trc Amp N-His TEV Life Technologies

pPROLar.A lac-ara1 Kan N-c-Myc EK p1 Clontech

pPROTet.E LtetO-1 Cam N-c-Myc EK ColE1 Clontech

pQE-9 T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen

pQE-16 T5-lac Amp C-His none ColE1 Qiagen

pQE-30/31/32 T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen

pQE-40 T5-lac Amp N-His N-DHFR none ColE1 Qiagen

pQE-60 T5-lac Amp C-His none ColE1 Qiagen

pQE-70 T5-lac Amp C-His none ColE1 Qiagen

pQE-80/81/82L T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen

pQE-100 T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen

pRSET T7 Amp N-His EK ColE1 Invitrogen

pSE280 trc Amp none none pUC Invitrogen

pSE380 trc Amp none none pUC Invitrogen

pSE420 trc Amp none none pUC Invitrogen

pThioHis trc Amp His-Patch EK Trx ColE1 Invitrogen

pTrc99A trc Amp none none pBR322 Pharmacia

pTrcHis trc Amp N-His EK pUC Invitrogen

pTrcHis2 trc Amp C-His none pUC Invitrogen

pTriEx-1 T7 Amp C-His none pUC Novagen

pTriEx-2 T7-lac Amp N-His C-His Thr EK pUC Novagen

pTrxFus PL Amp Trx EK ColE1 Invitrogen