酸）。在蛋白上樣后，帶有標簽的蛋白特異性結合到柱子里，其他的雜蛋白流出。Ni-NTA純化介質(zhì)是Ni離子金屬螯合介質(zhì)。
蛋白過鎳柱純化的原理：Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有HIs（組蛋白）標簽的堿性蛋白蛋白結合，組蛋白標簽一般是6個（堿性氨基酸）。在蛋白上樣后，帶有標簽的蛋白特異性結合到柱子里，其他的雜蛋白流出。Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以也可以與咪唑結合這時候再用咪唑洗脫，梯度洗脫，咪唑競爭性結合到硫酸鎳上，目的蛋白就被洗脫了，這時候收集浸出液，那么里面就是你要的目的蛋白，然后透析掉咪唑就行了。現(xiàn)在的柱子大多是預裝柱，也就是不用自己填柱，就是裝好鎳的傻瓜柱，也不貴，上樣，洗脫，基本兩個步驟就結束了。剩下的看你怎么處理了。
高親和Ni-NTA純化介質(zhì)（L00250）是把螯合劑（氮川三乙酸或NTA）共價偶聯(lián)到瓊脂糖介質(zhì)（4%交聯(lián)）上，然后再螯合Ni2+制備而成。NTA能夠通過四個位點牢固的螯合Ni2+從而減少純化過程中Ni2+泄露到蛋白樣品中。Ni-NTA純化介質(zhì)可以純化任何表達系統(tǒng)（原核，酵母，昆蟲細胞和哺乳動物細胞等表達系統(tǒng)）表達的天然或變性的His-標簽蛋白。結合在介質(zhì)上的蛋白可以通過低pH緩沖液、咪唑溶液甚至溶液洗脫下來。
一、NI-NTA提純操作步驟
1. 試劑和耗材準備：
Bind Buffer;Wash Buffer;Elution Buffer;柱子;填料;等。
pET.wap.ns②A1; PET21空載體; 200ml誘導表達菌液;
2. 步驟：
2.1 50ml滅菌離心管收集菌液，用冰冷10ml PBS清洗菌液1次，離心
2.2 重懸8ml bind buffer ，冰上超聲破碎，10s間隔，至菌液不在粘稠，分裝至EP管，
2.3 4℃ 14000r/min 20min，分離上清，沉淀用5ml Buffer A+DTT重懸
2.5混勻50%NI-NTA，吸2ml 50%NI-NTA ，上柱（做2個柱，1ml NI-NTA/柱），待*沉淀（約1h），先用10ml滅菌水洗，流速：重力作用
2.6 10ml 1*Bind Buffer 進行平衡，流速：重力作用
2.7 將準備好的樣品上樣，pET.wap.ns; PET21 only分別上柱（結合時間1h-1.5h流速控制在0.1ml/min左右， EP 管，分管收集上樣后液體）
2.8 10ml 1* Bind Buffer 洗柱子（收集洗脫液10管，流速在0.3-0.4ml/min左右）
2.9 10ml 1*Wash Buffer洗柱子（收集洗脫液10管，流速在0.3-0.4ml/min左右）
2.10 5ml 1* Elution Buffer洗柱子（收集洗脫液5管）
2.11 用15ml 0.5m NaoH清洗，時間約0.5-1h（0.5ml/min）
2.12 用20%乙醇清洗，約0.5-1h（0.5ml/min）
2.13 封好加樣口，柱子存放4℃備用
洗脫液-80保藏
試劑配方：
10×NI-NTA Bind Buffer （天然條件Binding/Lysis Buffer，100mL）
50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4·2H2O（MW 156.01g/mol）
300mM NaCl 17.53g NaCl（MW58.44g/mol）
10mM imidazole 0.68g咪唑（MW68.08g/mol）
NaOH調(diào)整PH至8.0，濾膜過濾
10×NI-NTA Wash Buffer （天然條件Wash Buffer，100m L ）
50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4·2H2O （MW 156.01g/mol）
300mM NaCl 17.53g NaCl（MW58.44g/mol）
20mM imidazole 1.36g咪唑（MW68.08g/mol）
NaOH調(diào)整PH至8.0，濾膜過濾
10×NI-NTA Elution Buffer（天然條件Elution Buffer.，100m L）
50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4·2H2O （MW 156.01g/mol）
300mM NaCl 17.53g NaCl（MW58.44g/mol）
250mM imidazole 17.0g咪唑（MW68.08g/mol）
NaOH調(diào)整PH至8.0，濾膜過濾
1X PBS （0.1M PBS, pH 7.4）:
137mM NaCl（MW58.44g/mol） --------------------------------------------- 8g
2.7mMKCl（MW74.55g/mol）----------------------------------------------- 0.2g
10mMNa2HPO4 （anhydrous） （MW141.98g/mol）----------------------- 1.42 g
2mMKH2PO4 （anhydrous） （MW136.09g/mol） ------------------------- 0.27g
Distilled water ----------------------------------------------------------- 1000 ml
Mix to dissolve and adjust pH to 7.4（ HCl ,調(diào)節(jié)）
高壓滅菌后，Store this solution at room temperature. Dilute 1:10 with distilled water before use and adjust pH if necessary.
二、Ni-NTA 常見問題及建議
純化的組分中沒有His 標簽的蛋白?
首先確定是蛋白沒有掛上柱還是蛋白沒有被洗脫下來。若His 標簽蛋白沒有與柱結合：
可能原因：超聲的功率不對（ 太大，蛋白炭化，太小，蛋白沒有釋放）
策略：改變超聲功率，并在超聲前加入
可能原因：樣品或者是結合緩沖液不正確：
策略：檢測pH 及樣品和結合緩沖液的組成份。確保在溶液中鰲合劑或強還原劑的濃度及咪唑的濃度不是太高。
可能原因：標簽暴露不*
策略：在變性條件下（ 用4-8 M 脲，或4-6 M 鹽酸胍） 進行純化。
可能原因：His 標簽丟失
策略1：WB 檢查His 是否表達，上游構建，改變His-tag 的位置（C- 端或 N- 端），必要時增加His 個數(shù)。
策略2：孵育的時間不夠，降低流速和增加孵育的時間。
策略3：改變螯合的金屬離子，尋找到*的結合金屬離子。
Ni2+ 通常是從宿主細胞蛋白中純化大多數(shù)6×His 標記的重組蛋白質(zhì)的金屬離子。也是一般zui常用的離子。蛋白和金屬離子之間的結合強度受幾種因素影響，包括長度、位置、親和標記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的pH，因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進行純化而不用Ni2+。
His 標簽蛋白若沒有洗脫下來，請依次檢查：
可能原因：洗脫條件太溫和（標記的蛋白質(zhì)仍然結合在柱上，結合力較強）
策略：用增加咪唑的梯度洗脫或降低pH 來找出*的洗脫條件。
可能原因：降低pH 的方法洗脫的，因為若pH 低于3.5，會導致鎳離子脫落
策略：改變洗脫辦法，咪唑競爭性洗脫
可能原因：蛋白已沉淀在柱上
策略：減少上樣量，或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCl 的濃度，或在變性條件（ 去折疊） 下洗脫（ 用4-8 M 脲，或4-6 M 鹽酸胍）。
可能原因：非特異性疏水或其他相互反應
策略：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如：2% Triton X-100）或增加NaCl 的濃度。
His 標簽蛋白洗脫后雜帶較多，什么原因? 如何優(yōu)化?
高純度的蛋白是純化工作者的追求，但是由于很多天然的蛋白也會帶有HIS，所以經(jīng)常會出現(xiàn)HIS 標簽蛋白洗脫后有一些雜帶，可能的原因和優(yōu)化的方法如下：
可能原因：蛋白酶部分降解了標簽蛋白
策略：請?zhí)砑拥鞍酌敢种苿?/span>
可能原因：雜質(zhì)對鎳離子有更高的親和性
策略1：咪唑濃度必須優(yōu)化，以確保高純度（ 宿主細胞蛋白質(zhì)的低結合） 和高產(chǎn)率（ 標記的目標蛋白質(zhì)的強結合） 之間的*平衡。分步或者線性洗脫摸索出*的咪唑結合和清洗濃度;在樣品中加入與結合緩沖液同樣濃度的咪唑;咪唑的梯度不大（20 個或更多的柱床體積），可能分離出有相似結合強度的蛋白
策略2：篩選的緩沖液條件，NaCl 濃度，pH 的范圍都需要進行篩選。對于單一目標蛋白在進行緩沖液篩選時，將緩沖液、鹽、甘和還原劑設計成不同的混合配方來進行優(yōu)化。
策略3：若以上優(yōu)化的條件都不能去除雜質(zhì)蛋白，需要考慮多步純化的思路，如利用Strep 標簽進行兩步純化或采用Subtractive method 進行純化。
可能原因：雜質(zhì)和標簽蛋白結合在一起
策略：在超聲破碎細胞之前加入去垢劑或者還原劑;增加去垢劑的濃度（ 2% Triton X-100 or 2% Tween 20）;或者在Wash buffer 中增加甘的濃度（50%） 減少非特異性的相互反應;考慮增加咪唑的濃度或者改變金屬離子。
可能原因：洗滌不充分
策略：增加洗滌的次數(shù)，使洗滌充分。
蛋白過鎳柱純化步驟中，因為現(xiàn)在很多都是預裝柱，也就不用自己裝填料了，一般的蛋白純化也就只有上樣和洗脫兩個步驟了。需要注意的是純化過程中流速不應該過快。
