1、誘導之后表達上清中檢測不到目的蛋白：

分析1：檢測的方法是否有問題，要考慮是不是蛋白表達量低而沒有檢測到?

如果是蛋白表達低，可以選擇濃縮蛋白，具體的方法很多，有TCA、丙酮、濃縮柱等等方法，之前在本版已經發過帖，在此不贅述。

2、如果蛋白濃縮N倍之后仍然檢測不到，那基本可以確證蛋白并不在上清中。那么蛋白到哪里去了，考慮是否沒有分泌出來，而是在胞內，那就需要通過裂解酵母來檢測胞內蛋白，具體的方法很多，在此也不贅述，曾整理過相關破碎的帖子。

3、如果胞內也沒有目的蛋白表達，那么基本可以確定蛋白并沒有表達。

4、為什么沒有表達呢?倒推回來就是誘導的過程了，誘導體系是什么?甲醇濃度是多少?培養問題是多少，轉速是多少?這些都要注意。甲醇一般是0.5%-1.0%，本人用的是0.5%，也有很多人也用1.0%，曾見過一個帖子，說超過1.5%反而會抑制表達，沒有驗證過，供大家參考。培養問題28-30度比較合適，轉速250rpm比較合適，誘導體系沒有固定的體系，說明書上的是BMGY到OD600 2~6，換到BMMY中OD600 為1左右。

5、如果誘導的過程也沒有問題，那問題就復雜了，特別是重組酵母PCR檢測證明目的基因確實已經發生了重組。這個時候是zui郁悶的了，但是郁悶怎么辦，還是要找原因，在此我給的建議是先做RT-PCR證明mRNA水平的情況，也就是說有沒有轉錄。如果轉錄了，后續的操作也沒有問題（本帖的1、2、3、4項），那么只有重新設計實驗，比如換酵母株，有文章上說：用GS115表達不出蛋白，換KM71H后，大部分克隆能表達。

6、有個帖子說的很好，在此和大家分享一下。

1、 菌株：用GS115表達不出蛋白，換KM71H后，大部分克隆能表達。

2、溫度：　在28度和室溫下誘導表達，表達水平可能都不低。

3、pH：手冊上用6.0，pH提高到6.8，不表達的蛋白可能就表達出來。BMMY的pH7.0-7.5比較合適。國內外做的的rHSA，zui適pH大概5-6左右。pH3的時候yeast和peptone好像會沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氫鉀調，具體比例自己去試試。

4、偏愛密碼子： codon bias一般不是主要的問題，你要表達的蛋白特性才是主要問題，酵母對分子量大（30KD以上），結構復雜（如一些蛋白酶），二硫鍵含量多的蛋白往往不能有效表達，尤其是分泌表達。密碼子改造對一些較小的而且結構簡單的蛋白表達量的提高可能有一些作用。比如一位戰友用Pichia酵母表達一個單鏈抗體，29KD，含有2對二硫鍵，表達量約幾毫克每升，選用酵母偏好密碼子全基因合成后，表達量沒有什么提高。

5、表達時間與空質粒轉化對照：誘導時間長了以后，是會有很多蛋白分泌出來的，時間越長雜蛋白就越多，且分子量都比較大。做一個空質粒轉化的對照，這樣就會比較肯定到底是不是自身的蛋白分泌的結果。

6、污染：每個樣品從G418板上挑10個左右單克隆于2ml BMGY搖菌（30ml玻璃管，比LB管大一點），紗布一般用8層，一天左右看著比較渾離心，留樣1ml，余1ml換2ml BMMY誘導表達，3,4層紗布足夠了。

污染一般都是跟瓶口覆蓋有關的原因造成的，只蓋紗布肯定會污染。加蓋報紙后，就再沒遇到過污染。如果只用6層紗布，污染的可能當然很大，100ml三角瓶，裝量10ml培養液，用橡筋把8層紗布和2層報紙拴緊封口，空氣浴搖床。

7、不表達：蛋白有沒有表達就要看你的運氣了，一般重復2-3次實驗都沒有表達菌株，這個蛋白就放棄表達了。

8、表達量： 30KD,10mg/L表達量已經很高，zui直接的方法是發酵，一般提高5-10倍。大腸桿菌一樣出現大團的超表達蛋白。

9、糖基化：酵母分泌表達的N糖基化是可以預測的，有如下序列：N X S/T就是潛在的糖基化位點，X為任意氨基酸，1個糖基化位點會加上1-3KD左右的糖基。另外可能還有O糖基化話，但是無法預測其位點，不過很少聽說表達蛋白有O糖基化的。如果胞內表達，不存在糖基化的問題。

10、表型與表達：重組SalI和BglII酶切產生單交換和雙交換，結果就是產生Mut+和Muts表型的菌株;前者在甲醇誘導表達時生長快，消耗的甲醇多，后者生長慢，消耗的甲醇少，所以誘導表達時Muts表型要求更高的菌體濃度。一般用Mut+表型的較多，但是對某些蛋白Muts菌株可能表達的更好，只有試試才知道你的蛋白用那種菌株表達較好。

11、培養基

YPD：zui基本的培養用;BMGY：誘導表達前培養用;BMMY：誘導表達用;MD：電轉化后篩選his+用。

YEPD是不能代替BMGY的，因為有葡萄糖，這樣殘留的葡萄糖會影響下一步的誘導表達。不過有一種方法是可行的，就是用YPG培養基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘代替，也可以降低成本。搖瓶畢竟不能和發酵罐比，油殘余會抑制甲醇利用。

BMGY、BMMY滅菌后才能加甲醇、磷酸鉀、。配制BMMY時也沒必要用5%過濾除菌的甲醇，在滅菌后使用前加甲醇至你要的濃度。

YNB可以高壓滅菌，沒問題的，也可以0.22um過濾處理，天冬氨酸和要待培養基高壓滅菌后加入;配YPD時可以加入YPD一起滅菌，但時間不能太長，溫度不能太高，一般121-125度12-15分鐘足夠了。若時間過長，溫度過高，可能導致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易產生美拉德反應，這是配制培養基中的禁忌。顏色很深的話，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培養基108度35min高壓滅菌。

小量發酵其實可以把培養基成分中的YNB和去除，培養基價格便宜，操作又方便，可以直接滅菌，效果也很好（效果不比含YNB的差）。

如果是用自己配置的培養基，如玉米浸提液、麥芽浸提液、麥麩浸提液等等，可以不用換液，采取添料來維持酵母對培養基的營養需要。

用無機鹽進行大規模發酵，更省錢。