蛋白質(zhì)定量貌似簡單的實(shí)驗(yàn)，其實(shí)還是有一些學(xué)問的，蛋白質(zhì)測(cè)定的方法有很多種，到目前為止還沒有哪種方法符合大眾所有的要求的，本文總結(jié)了Bradford斑點(diǎn)試驗(yàn)、Coomassie 斑點(diǎn)試驗(yàn)、紫外分光度檢測(cè)法以及BCA法.
一、Bradford法
該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)定量是相當(dāng)?shù)模貏e是用于小分子多肽定量。如核糖核酸酶或等。但是，去污劑的濃度超過0.2%則影響定量結(jié)果。如TritonX-100，SDS，NP-40等。
1. Bradford染液配制：將100mg考馬斯亮藍(lán)溶于50 ml 95%的乙醇中，加入100ml 濃磷酸，然后，用雙蒸水補(bǔ)充至200ml，放4C至少6個(gè)月。
2. 作標(biāo)準(zhǔn)曲線的蛋白質(zhì)樣本的準(zhǔn)備：盡量使用與待測(cè)樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，例如進(jìn)行抗體定量，可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。如果待測(cè)樣本是未知的，也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。通常在20μg-150μg/100μl之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3. 將待測(cè)樣本溶于100μl緩沖溶液中，該緩沖溶液應(yīng)于作標(biāo)準(zhǔn)曲線的緩沖溶液相同;
4. 按1：5用雙蒸水稀釋濃染料結(jié)合溶液，過濾離心沉淀物;
5. 每個(gè)樣本加5ml稀釋的染料結(jié)合溶液，作用5-30min。染液與蛋白質(zhì)結(jié)合后，將由紅色變?yōu)樗{(lán)色，即可在595nm光波長下測(cè)定其吸光度。注意，顏色反應(yīng)不得超過30min;
6. 應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本的濃度。
注意：應(yīng)用Bradford法測(cè)定BSA的值是其重量的兩倍。
二、Bradford斑點(diǎn)試驗(yàn)
該方法特別適用于檢測(cè)洗脫組分，以定位蛋白洗脫液。例如檢測(cè)洗脫液的吸附力的強(qiáng)弱。
1. 首先，濃縮Bradford染液。將100mg考馬亮藍(lán)溶于50 ml 95%的乙醇中，加入100ml 濃磷酸，然后，用雙蒸水補(bǔ)充至200ml，放4C至少6個(gè)月。這種染液也可從Bio-Rad公司購到;
2. 將8μl待測(cè)蛋白質(zhì)樣本轉(zhuǎn)移至一 條Parafilm，Saran Wrap上或微孔板孔中。同時(shí)應(yīng)設(shè)一洗脫液樣本作為空白對(duì)照;
3. 每個(gè)樣本孔中加2μl濃Bradford染液并混勻;
4. 大約2min后，含有蛋白質(zhì)的樣本將變藍(lán)。該方法的靈敏度約為10μg/ml。此反應(yīng)對(duì)去污劑的濃度超過0.2%時(shí)非常敏感。但KCl，NaCl，MgCl2 或EDTA對(duì)其無影響，Tris對(duì)其僅有輕微的影響。
三、Coomassie 斑點(diǎn)試驗(yàn)
該方法特別適用于檢測(cè)洗脫組分以定位蛋白洗脫液。例如檢測(cè)洗脫液的吸附力的強(qiáng)弱。
1. 裁剪3MM厚的Whatman 紙約4mm2 ;
2. 每個(gè)樣本點(diǎn)5μl于Whatman 紙上;
3. 自然干燥樣本或用電吹風(fēng)吹干斑點(diǎn)，約1min或更少;
4. 將紙塊浸入0.25%的考馬斯亮藍(lán)溶液中（考馬斯亮藍(lán)溶于10%的甲醇，7%醋酸中） 30min;
5. 將紙塊放入10%的甲醇，7%醋酸溶液中洗滌3-5 min，然后干燥。
四、紫外分光度檢測(cè)法
蛋白質(zhì)紫外光吸光率是所有的蛋白質(zhì)定量方法中zui快的方法。通常在280nm光波長下讀數(shù)。其在280nm光波長下的zui大吸光率主要處決于和的存在。在205nm光波長的吸收也常用到。其在205nm光波長下的zui大吸光率主要處決于肽鏈，盡管氨基酸也有影響。另外，一個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)是在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)，樣本不會(huì)遭到損害。
1、純蛋白質(zhì)溶液：
① 在280nm光波長下讀取與適當(dāng)?shù)膶?duì)照相比較的吸光率;
② 對(duì)于抗體和BSA，可應(yīng)用下表計(jì)算其濃度對(duì)其他蛋白質(zhì)可粗約地估計(jì)：1個(gè)單位吸光率相當(dāng)于1mg/ml。
蛋白質(zhì) A280 （1mg/ml）
IgG 1.35
IgM 1.2
BSA0.7
2、含有核苷酸的蛋白質(zhì)溶液
① 在280nm和260nm或280nm和205nm光波長下讀取與適當(dāng)?shù)膶?duì)照相比較的吸光率;
② 用下列等式粗略計(jì)算其濃度：
蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=（1.55×A280 ）-（0.76×A260 ）
蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）= A205 /（27 + 120 A280/ A205 ）
五、BCA法：
由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以算出樣品原始濃度為14.28mg/ml
BCA法特點(diǎn)： 1. 靈敏度高，檢測(cè)濃度下限達(dá)到25μg/ml，zui小檢測(cè)蛋白量達(dá)到0.5μg，待測(cè)樣品體積為1-20μl 。 2. 測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的去污劑等化學(xué)物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高達(dá)5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。 3. 在20-2000μg/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。 4. 檢測(cè)不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量。 5. 受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巰基乙醇低于1mM
BCA法和Commassie法各有優(yōu)勢(shì)，在不知道蛋白樣本緩沖液成分的情況下可以兩種方法配合使用，以消除定量的誤差。
Bradford法、Coomassie 法、紫外分光度檢測(cè)法以及BCA法各有優(yōu)缺點(diǎn)，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的去選擇合適的蛋白定量方法，主要依據(jù)是緩沖液的化學(xué)組成和待測(cè)的蛋白的濃度。
