隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，尤其是基因工程的進(jìn)步，越來(lái)越多的蛋白質(zhì)藥物逐漸被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于疾病治療中，因此掌握將目的蛋白質(zhì)zui快zui有效地分離提取純化出來(lái)的方法，越來(lái)越重要，本文就蛋白質(zhì)的提取、分離純化作個(gè)介紹。

一、蛋白質(zhì)（包括酶）的提取

大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類(lèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。

（一）水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)zui常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時(shí)需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時(shí)間。但另一方面，溫度升高會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質(zhì)提取過(guò)程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。

1、pH值

蛋白質(zhì)，酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH 范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時(shí)，應(yīng)防止過(guò)酸或過(guò)堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來(lái)說(shuō)，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。

2、鹽濃度

稀鹽濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，稱(chēng)為鹽溶作用。同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn)，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾/升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等鹽溶液。

（二）有機(jī)溶劑提取法

一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑，它們具有一定的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性，是理想的脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對(duì)提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別*，一是因?yàn)槎〈加H脂性強(qiáng)，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng);二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會(huì)引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動(dòng)植物及微生物材料。

二、蛋白質(zhì)的分離純化

蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有：

（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法

1、蛋白質(zhì)的鹽析

中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱(chēng)鹽溶;當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱(chēng)鹽析。將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO42-和NH4+）有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。

影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4℃）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶解度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時(shí)溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶解度zui低。（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(lái)（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前要加等量生理鹽水稀釋?zhuān)沟鞍踪|(zhì)含量在2.5-3.0%。

蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應(yīng)用zui多的硫酸銨，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時(shí)飽和溶液為4.1M，即767克/升;0度時(shí)飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來(lái);另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。

蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)，用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時(shí)間較長(zhǎng)，所以在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡聚糖凝膠G-25或G-50過(guò)柱的辦法除鹽，所用的時(shí)間就比較短。

2、等電點(diǎn)沉淀法

蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)顆粒之間的靜電斥力zui小，因而溶解度也zui小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。

3、低溫有機(jī)溶劑沉淀法

用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行。

（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾

透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開(kāi)。

超濾法是利用高壓力或離心力，強(qiáng)迫水和其他小的溶質(zhì)分子通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)被截留，可選擇不同孔徑的濾膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。

2、凝膠過(guò)濾法

也稱(chēng)分子排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物zui有效的方法之一。柱中zui常用的填充材料是葡聚糖凝膠（Sephadex gel）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。選擇不同的分子量凝膠可用于脫鹽、置換緩沖液及利用分子量的差異分離不同蛋白質(zhì)或除去熱源。

（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離

蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開(kāi)。

1、電泳法

各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開(kāi)。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí)，到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。

2、離子交換層析法

離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑（如：羧甲基纖維素;CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素;DEAE纖維素），當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，溶液pH大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電，用陰離子交換層析，否則相反。隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。

（四）根據(jù)配體特異性的分離方法-親和色譜法

親和層析法是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過(guò)一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái)，而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱(chēng)為配體的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合。

親和層析法的特點(diǎn)是：

1. 結(jié)合效率高，分離速度快。配基可是酶的底物、抑制劑、輔因子、特異性的抗體;

2. 吸附后可用改變緩沖液的離子強(qiáng)度和pH的方法，將目標(biāo)蛋白洗脫下來(lái)，也可用更高濃度的同一配體溶液或用與配體親和力更強(qiáng)的溶液洗脫。

3. 依親和選擇性的高低分為：基團(tuán)性親和層析，固定相上的配基對(duì)某一類(lèi)基團(tuán)的*的親和力。如含有糖基的一類(lèi)蛋白質(zhì)或糖蛋白對(duì)三嗪染料顯示特別強(qiáng)的吸附能力;高選擇性（專(zhuān)一性）親和層析，配基僅對(duì)某一種蛋白質(zhì)有特別強(qiáng)的親和性。如單克隆抗體對(duì)抗原的特異性的吸附。

4. 親和層析除特異性的吸附外，仍然會(huì)因分子的錯(cuò)誤識(shí)別和分子間非選擇性的作用力而吸附一些雜蛋白質(zhì)，令洗脫過(guò)程中的配體不可避免的脫落進(jìn)入分離體系。

親和層析法按配基的不同可分為：

（1）金屬螯合介質(zhì)

過(guò)渡金屬離子Cu2+、Zn2+和Ni 2+等以亞胺絡(luò)合物的形式鍵合到固定相上，由于這些金屬離子與、和半之間形成了配價(jià)鍵，從而形成了亞胺金屬—蛋白螯合物，使含有這些氨基酸的蛋白被這種金屬螯合親和色譜的固定相吸附。螯合物的穩(wěn)定性受單個(gè)和半解離常數(shù)所控制，從而亦受流動(dòng)相的pH和溫度的影響，控制條件可以使不同蛋白質(zhì)相互分離：例如減少洗脫液的pH;競(jìng)爭(zhēng)洗脫，可用不同濃度的咪唑，，氯化銨或其他能與金屬離子結(jié)合的試劑洗脫。

（2）小配體親和介質(zhì)

配體有、苯甲酰胺、鈣調(diào)因子、肝素和賴(lài)氨酸等等。

（3）抗體親和介質(zhì)

即免疫親和層析，配體有重組蛋白A和重組蛋白G，但蛋白A比蛋白G專(zhuān)一，蛋白G能結(jié)合更多不同源的IgG。

（4）顏料親和介質(zhì)

染料層析的效果除主要取決于染料配基與蛋白的親和力大小外，還與洗脫緩沖液的種類(lèi)、離子強(qiáng)度、pH值及待分離的樣品的純度有關(guān)。配體有Cibacron Blue和Procion Red兩種。在一定的條件下，固定化的染料能起陽(yáng)離子交換劑的作用，為了避免此現(xiàn)象的發(fā)生，要離子強(qiáng)度小于0.1和pH大于7時(shí)操作。主要用于純化蛋白、干擾素、等。

（5）外源凝集素親和介質(zhì)

配體有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麥芽外源凝集素，固定相外源凝集素能和數(shù)種糖類(lèi)殘基發(fā)生可逆反應(yīng)，適合純化多糖、糖蛋白、膜蛋白等。

（6）核酸親和介質(zhì)

配體有AMP，polyA（U）等，純化NADP+ 依賴(lài)脫氫酶和其他對(duì)NADP+有親和作用的酶，或純化mRNA-結(jié)合蛋白，聚合酶，mRNA,逆轉(zhuǎn)錄酶等。

（五）根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性差異

多數(shù)疏水性的氨基酸殘基藏在蛋白質(zhì)的內(nèi)部，但也有一些在表面。蛋白質(zhì)表面的疏水性氨基酸殘基的數(shù)目和空間分布決定了該蛋白質(zhì)是否具有與疏水柱填料結(jié)合，從而利用它來(lái)進(jìn)行分離的能力。

高濃度鹽水溶液蛋白質(zhì)在柱上保留，在低鹽或水溶液蛋白質(zhì)從柱上被洗脫，故特別適用于濃硫酸銨溶液沉淀分離后的溶液以及該沉淀用鹽溶解后的含有目標(biāo)產(chǎn)品的溶液直接進(jìn)樣到柱上，當(dāng)然也適用7mol/鹽酸胍或8mol/L脲的大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)提取液直接進(jìn)樣到柱上，在分離的同時(shí)也進(jìn)行了復(fù)性。

（六）基因工程構(gòu)建的純化標(biāo)記

通過(guò)改變 cDNA在被表達(dá)的蛋白的氨基端或羧基端加入少許幾個(gè)額外氨基酸，這個(gè)加入的標(biāo)記可用來(lái)作為一個(gè)有效的純化依據(jù)。

1. GST融合載體

使要表達(dá)的蛋白質(zhì)和S轉(zhuǎn)移酶一起表達(dá)，然后利用Glutathione Sepharose 4B作親和純化，再利用或因子X(jué)a切開(kāi)。

2. 蛋白A融合載體

使要表達(dá)的蛋白和蛋白A的IgG結(jié)合部位融合在一起表達(dá)，以IgG Sepharose純化。

3. 含標(biāo)記（Histidine-tagged）Chelating Sepharose

zui通行的標(biāo)記之一，是在蛋白質(zhì)的氨基端加上6～10個(gè)，在一般或變性條件（如8M尿素）下借助它能與Ni2+螯合柱緊緊結(jié)合的能力，用咪唑等洗脫，或?qū)H降至5.9（pH4-6是一個(gè)能很好分離蛋白的區(qū)間，也用到pH3-4）使充分質(zhì)子化，不再與結(jié)合Ni2+使之得以純化。

蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類(lèi)型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學(xué)中的重要的一部分，至今還沒(méi)的單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來(lái)，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。

zui后提醒一下，蛋白質(zhì)的分離提取純化是生物化學(xué)的一個(gè)重要組成部分，不過(guò)由于蛋白質(zhì)廣泛分布于各種不同類(lèi)型的細(xì)胞核組織中，目前尚無(wú)特別簡(jiǎn)單便捷快速的方法一次性將一種蛋白提取純化出來(lái)，往往需聯(lián)合幾種方法使用才行。