單克隆抗體（McAb）與各種標記技術相結合成為研究細胞分化抗原、活化抗原和各種受體的重要手段。常用方法有免疫熒光技術、流式細胞儀（FCM）、犆8免疫組化技術以及免疫沉淀、SDS-PAGE分析等。125I標記單克隆抗體進行競爭結合試驗，可以計算出每個細胞表面平均抗原數量以及抗原抗體結合的親和力，是分子免疫學中一種重要的研究方法。

（一）　原理

125I標記的單克隆抗體能與具有相應抗原的細胞結合，犜Z有數百倍以上未標記的特異性抗體同時存在的條件下，則標記抗體的結合受到競爭性抑制。根據不同稀釋度抗體分別與相同數量細胞結合后所測得的特異性計數值，可以計算出每個細胞表面的平均抗原密度以及抗原和抗體的親和力。

（二）　操作步驟

                                硅化規格相同的5ml玻璃管，雙蒸水沖凈后烤干，
　　　　　　　　每次實驗分6～12組，每組5支試管
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　　　　　　　　將１２５I標記抗體和非標記抗體分別用結合緩沖液作
　　　　　　　　倍比稀釋
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　　　　　　　　在同一組5個試管中每管加入10μl標記抗體，4、
　　　　　　　　5管加入10μl未標記抗體（濃度高于同組標記抗體
　　　　　　　　100倍以上），1、2、3管補加10μl結合緩沖液
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　　　　　　　　洗滌分離或培養的細胞，用結合緩沖液調整細
　　　　　　　　胞濃度為5×10５～1×10６／80μl，每管中加入
　　　　　　　　80μl細胞懸液
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　　　　　　　　輕輕振搖后在4℃條件下（冷室或冰浴上）
　　　　　　　　孵育30min
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　　　　　　　　將孵育后的細胞懸液疊加于預先置小塑料
　　　　　　　　管內的200μl分離液上
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　　　　　　　　　　臺式高速離心機10,000g 2min
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　　　　　　　　　　　切下位于管底細胞小團
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　　　　　　　　　　　　　　　γ計數

計算:

1.　特異性計數值=總計數值（每組1、2、3管平均cpm值）-非特異性計數值（每組4、5管平均cpm值）。

2.　結果用LIGAND和EBDA微機程序進行Scatchad分析，計算出細胞表面抗原密度以及抗原與抗體結合的親和力。

（三）　試劑器材

1.　分離或培養的細胞

2.　125I標記的McAb、未標記抗體

3.　結合緩沖液（binding buffer: RPMI1640, PH7.2，1%BSA，20mM Hepes）

4.　細胞分離液80% Silicone oil/20% paraffion oil

5.　試管、塑料管、高速臺式離機

6.　Prosil-28硅化油

（四）　注意事項

1.　每管所需要細胞數根據細胞種類而定，一般在5×105～1×106/管，若用血小板可用1×108/管。

2.　所用McAb要求純度好、活性高。用氯胺-T法標記抗體時，氯胺-T作用時間不要超過30秒，比活性以3～6μci/μg McAb為宜，標記率在50～70%，犚T保持125I標記后McAb的結合活性。

3.　細胞、抗體等計數、取樣要。

4.　孵育時間和溫度視競爭結合試驗所用細胞和抗體的不同有所差別，可在室溫或37℃條件下進行，孵育時間30min～4h不等。

5.　在整個操作過程中防止未標記抗體對只加標記抗體管的污染，否則會使整個實驗失敗。