適用儀器

試驗方案

1. 準備細胞

2. 添加LysoBriteDeep Red染料工作溶液

3. 在37°C孵育30分鐘至60分鐘

4. 添加染色緩沖液

5. 室溫孵育30分鐘

6. 在熒光顯微鏡下Ex/Em =590/620nm（Texas Red濾光片組）處進行分析

注意：1）實驗前，取出試劑盒進行室溫凍結。

樣品示例及使用方法

1.準備溶酶體染色溶液：

1.1  取出試劑盒中A、B、C組分，室溫避光靜置5-10min。

1.2  移取10μL LysoBrite Deep Red（組分A），用5mL細胞染色緩沖液（組分B）進行稀釋，制備染料工作液。

注意：1) 10μL的500X LysoBrite Deep Red（組分A）足夠完成一個96孔板，根據要求分裝并儲存未使用的500X LysoBrite Deep Red（組分A），避免反復凍融。

2)熒光溶酶體指示劑的濃度根據實際應用而改變，可以根據探針的滲透性對細胞類型、細胞或組織的染色條件進行調整。

2.細胞染色：

• 對于貼壁細胞：

在96孔黑色墻壁/透明底板（50μL/孔/ 96孔板）或裝有適當培養基內的培養皿的蓋玻片上培養細胞，當細胞達到所需的匯合時，在96孔板或培養皿內加入1/2的LysoBrite Deep Red工作液，在37℃、5％CO2條件下培養箱中孵育30分鐘至60分鐘，將(50 µL /孔/96孔板）的染色緩沖液B（組分C）加入LysoBrite Deep Red工作溶液板中，在室溫下孵育15-30分鐘。再使用配有Texas Red 濾片組的熒光顯微鏡觀察細胞，使之帶深紅色熒光(Ex/Em = 590/620 nm)。

注意：1）LysoBrite Deep Red對細胞的毒性很小或沒有，它可以用于細胞跟蹤。為了進行細胞跟蹤，可跳過添加染色緩沖液B的步驟，只需將染料工作液替換為生長培養基，然后在熒光顯微鏡下觀察即可。如果細胞看起來沒有充分染色，建議適當增加染料濃度或孵育時間。

• 對于懸浮細胞：

在1000rpm條件下離心培養液5分鐘，得到細胞沉淀并棄去上清液，在預熱（37℃）生長培養基例如（100 µL /管）中輕輕重懸細胞沉淀，然后添加1/2體積（50 µL /管）LysoBrite Deep Red工作溶液。在37℃、5％CO2條件下培養箱中孵育30分鐘至60分鐘，將(50 µL /孔/96孔板）的染色緩沖液B（組分C）加入LysoBrite Deep Red工作溶液板中,在室溫下孵育15-30分鐘。再使用配有Texas Red 濾片組的熒光顯微鏡觀察細胞，使之帶深紅色熒光(Ex/Em = 590/620 nm)。

注意:  1）LysoBrite Deep Red對細胞的毒性很小或沒有。它可以用于細胞跟蹤。為了進行細胞跟蹤，可跳過添加染色緩沖液B的步驟，只需將染料工作液替換為生長培養基，然后在熒光顯微鏡下觀察即可。如果細胞看起來沒有充分染色，建議適當增加染料濃度或孵育時間。

       2）懸浮細胞可以附著在用BD Cell-Tak®（BD Biosciences）處理過的蓋玻片上，并作為貼壁細胞染色。

示例數據分析及圖示

圖一：在Costar黑色透明底96孔板中用Cell Navigator 溶酶體染色試劑盒LysoBrite Deep Red染色Hela細胞的熒光成像結果。

圖二：HeLa細胞分別用A和B，置于Costar黑壁/透明底96孔板中染色后的熒光成像結果，在0秒和120秒的曝光時間下，使用Olympus熒光顯微鏡對信號進行比較。 A: Cell Navigator溶酶體染色試劑盒(Cat# 22659)、B: LysoTracker®Red DND-99(來自Invitrogen公司)。