α酮戊二酸脫氫酶（α-KGDHC）試劑盒使用說明書

【資料簡介】

本試劑盒僅供研究使用。

檢測范圍：                                                          96T

6 IU/L– 250IU/L

使用目的：

本試劑盒用于測定微生物樣本中 α酮戊二酸脫氫酶(α-KGDHC)活性。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中 α酮戊二酸脫氫酶(α-KGDHC)水平。用純化的 α酮戊二酸脫氫酶(α-KGDHC)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入 α酮戊二酸脫氫酶(α-KGDHC)，再與HRP標記的 α酮戊二酸脫氫酶(α-KGDHC)抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 α酮戊二酸脫氫酶(α-KGDHC)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中 α酮戊二酸脫氫酶(α-KGDHC)活性濃度。

試劑盒組成

1	30倍濃縮洗滌液	20ml×1瓶	7	終止液	6ml×1瓶
2	酶標試劑	6ml×1瓶	8	標準品（400IU/L）	0.5ml×1瓶
3	酶標包被板	12孔×8條	9	標準品稀釋液	1.5ml×1瓶
4	樣品稀釋液	6ml×1瓶	10	說明書	1份
5	顯色劑A液	6ml×1瓶	11	封板膜	2張
6	顯色劑B液	6ml×1/瓶	12	密封袋	1個

標本要求

1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

200IU/L	5號標準品	150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液
100IU/L	4號標準品	150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液
50IU/L	3號標準品	150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液
25IU/L	2號標準品	150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液
12.5IU/L	1號標準品	150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液

2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7.溫育：操作同3。

8.洗滌：操作同5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11.測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。