培養(yǎng)基成纖維細(xì)胞的排除方法研究

．培養(yǎng)基機(jī)械刮除法：

　　是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序?yàn)椋?/p>

　　（）標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的部位；

　　（2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無(wú)菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無(wú)標(biāo)記空間；

　　（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞；

　　（4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至*除掉為止

2．反復(fù)貼壁法：

　　根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液，把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細(xì)胞相互分離，操作方法與傳代相同。

　　（）待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用消化后，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液；

　　（2）取編號(hào)為此A、B、C三個(gè)培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向A瓶中補(bǔ)充少許*培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；

　　（3）培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補(bǔ)加*培養(yǎng)基。

　　當(dāng)三個(gè)瓶?jī)?nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見(jiàn)A瓶主要為成纖維細(xì)胞，B瓶?jī)深惣?xì)胞相雜，C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。

3．消化排除法：

　　此法曾用于乳癌細(xì)胞的培養(yǎng)，具體程序是：

　　（）先是用0.5%和0.02％EDTA（：）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來(lái)后，便立即停止消化；

　　（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶?jī)?nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落。經(jīng)過(guò)幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細(xì)胞除凈。

4．膠原酶消化法：

　　本法是利用成纖維細(xì)胞對(duì)膠原酶較為敏感的特點(diǎn)，通過(guò)消化進(jìn)行選擇。

　　（）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化；

　　（2）用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞未被除凈，可再次重復(fù)。

5．其它方法：

　　有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基基生長(zhǎng)的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重.025～.085的密度梯度離心液，加入細(xì)胞懸液后，在23℃中800g離心0分種。在比重.025～.050層為成纖維細(xì)胞，在比重.050～.085層為上皮細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)分離進(jìn)行培養(yǎng)。zui近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SOD抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。