核糖核酸酶保護實驗(Ribonuclease protection assay，RPA)是近十年發展起來的一種全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是將標記的特異RNA探針(32P或)與待測的RNA樣品液相雜交，標記的特異RNA探針按堿基互補的原則與目的基因特異性結合，形成雙鏈RNA;未結合的單鏈RNA經RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測目的基因與特異RNA探針結合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保護實驗。對于32P標記的探針，雜交雙鏈進行變性聚丙酰胺凝膠電泳，用放射自顯影或磷屏成像系統檢測被保護的探針的信號;對于標記的探針，雜交雙鏈經過變性聚丙酰胺凝膠電泳后電轉移至尼龍膜，采用鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(Streptavidin-HRP)和化學發光底物與膜上biotin標記的探針結合，X射線膠片或化學發光圖像分析儀檢測雜交信號。

RPA是一種有力的工具，可用于檢測在總RNA混合物中特定mRNA分子的表達。盡管操作比較復雜，但是這種方法可以在一次檢測中分析多達25樣品。敏感性和高通量的優點使得RPA在病原體的發現中顯得非常有用。由RPA得到的結果，結合普通的形態學技術有助于闡明疾病的發生過程。

RPA有Northern blot*的優勢：

1.過量的探針與目的基因的雜交在液相環境完成，反應更加*

2.RPA比Northern Blot靈敏15-150倍，適合檢測各種表達水平之基因

3.RPA通量高，同時檢測多個基因，可評價他們在同一情況下的差異表達

4.一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度

這個方法的的主要缺點如下：

1.這個實驗的前提是你必須首先要把要研究的基因克隆于一個載體，要清楚插入片段的方向，該載體插入片段兩側有T3、T7或SP6的啟動子位點。載體先要用合適的內切酶線性化，選擇正確的體外轉錄試劑盒，轉錄出要研究的mRNA 的互補鏈，再純化。總之RNA探針的制備夠麻煩。

2.核酸酶消化時，酶量的控制困難，容易消化過頭，X片上什么都沒有。

3.要用放射性同位素。從事生物研究的人誰不接觸放射性物質?但是該方法中不同于一般的探針標記，體積小，防護容易。它需要做垂直板狀PAGE，還要漂洗固定，粘有放射性的物質太多，如電泳的緩沖液、電泳槽、玻璃板、漂洗固定液及托盤。這還沒有算上RNA探針標記及隨后的純化過程。

可能出現的問題及應對措施：

1.No Discrete Bands, Only Smears--RNA degraded, or the the RNase Digestion was too harsh.Try reducing the concentration of RNase A to 1 mg/ml or digest for a shorter period of time. Check your RNA for condition.

2.Bands Too Large, High Molecular Weight Artifacts--The RNase Digestion was inefficient and unable to effectively trim down the RNA:RNA duplexes.Try RNasing longer or increasing the RNase concentration. /Incompley linearized template DNA.

3.Bands in the Negative Control Lane-- Inefficent RNase Digestion (see above)/Sense template contaminating riboprobe/Insufficent DNase digestion of riboprobe.

4.Many Lower Molecular Weight Bands Under the Main Band--There can either be premature stop sites in the probe leading to smaller probe sizes, therefore smaller products. This can also stem from overdigestion by RNase A which will break-up the duplexes if the concentration or digestion time is too long.

5.No Signal At All: You did generate an antisense probe right?

RPA和SAGE的相同點和不同點：

兩者的相同點都在于根據不同的RNA分子有不同的特征序列，以此為依據，分析基因的表達情況;兩者的不同點在于，具體檢測RNA的原理不一樣，相比較而言，前者利用RNase只消化單鏈RNA(即未與RNA probe結合的RNA分子)的特性，定性兼半定量分析特定(視合成的probe)基因的表達，后者是基于只需14bp長的核酸序列即可代表一個RNA分子，用擴增的方式，定性的研究可以檢測到一個細胞內所有轉錄體的表達