DNA的重組

(一)DNA的酶切與連接

(1)酶切反應

同質粒dna的鑒定，只不過是質粒DNA換為載體DNA。若大量酶切，則成比例增加。

(2)加2倍體積的預冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。

(3)15000rpm離心15min，棄上清。

(4)加入75%乙醇洗滌2次，離心棄上清，真空抽干。

(5)加入適量1×TE溶解。如此可得線性化載體DNA。

(6)測定DNA的含量。

(7)加入線性載體DNA和含量3～4倍于載體的待插入dna片段，連接緩沖液及T4連接酶適量至總體積為20μl，在12～14℃反應12～16h。

(8)連接反應液可置-20℃保存，供轉化用。

(9)關于待插入DNA片段的獲得參見附注。

(二)大腸桿菌感受態的制備及重組DNA的轉化

1.感受態的制備

(1)接種單菌落于2ml LB培養液中， 37℃過夜。

(2)取0.25ml過夜菌入25ml LB培養液中，37℃振搖4～6h至A590=0.4～0.6。

(3)倒入50ml管內，水浴10min，以2500～3000rpm離心5min，棄上清。

(4)緩慢加入75mmol/L預冷CaCl25ml懸浮菌體，冰浴20min，同上離心棄上清。

(5)緩慢加入75mmol/L預冷CaCl21.0ml輕輕混勻后分裝在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。

2.重組DNA的轉化

(1)將3只Eppendorf管按下列轉化項目作好標記，然后按下述進行：

轉化項目     受體菌     DNA     總體積
DNA對照組     0     10μl     200μl
受體菌對照組     200μl     0     200μl
轉化組     190μl     10μl     200μl
(2)冰浴30min至1h。中間搖動3次，以防受體菌沉底。

(3)42℃90s。

(4)37℃水浴5min。

(5)加入無相應抗生素的Lb 200μl，混勻后，37℃水浴30～60min。

(6)分別取3組反應物各50μl在含相應抗生素的固體LB培養基平皿上涂布，室溫下干燥，然后倒置于37℃溫箱中培養過夜。

(三)轉化子DNA的快速鑒定-快速細胞破碎法

(1)挑取轉化平板上的單菌接種于含相應抗生素的2ml LB中，37℃振蕩培養至A590值為0.6～0.8。

(2)取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm離心9min，去盡上清。

(3)加入70μl Cracking Gel緩沖液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚藍1.67ml，加雙蒸水至200ml]，混勻后，37℃水浴30min以上。

(4)15000rpm離心15min。

(5)吸取上清點樣電泳，觀察。

(四)轉化子DNA的酶切鑒定

1.轉化子DNA的快速少量抽提

(1)同本節 二.(三).1.

(2)菌液移至5ml Eppendorf 管中，9000rpm,離心9min，去上清。

(3)加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混勻，冰浴10min。

(4)15000rpm離心15min。

(5)吸取上清，加入異丙醇1ml混勻，置室溫15～30min。

(6)15000rpm離心15min，棄上清，加入75%乙醇洗滌2次。

(7)離心棄上清，真空抽干，加入適量1×TE溶解DNA。

(8)取少量DNA電泳，觀察濃度。

2.轉化子DNA的小量酶切鑒定 同質粒DNA的小量酶切鑒定，見本節 一(三)。

(五)重組子DNA的進一步鑒定

可用Southern印跡雜交法或斑點雜交法等進一步鑒定，詳見本節 四。

[附]電泳洗脫法回收酶切DNA片段

(1)用合適的酶切割DNA并電泳。

(2)于紫外燈下從凝膠上切下所要的DNA帶，裝入含1×TBE緩沖液的透析代內，用夾子封好袋口，并檢查有無漏孔。

(3)將透析袋(縱長)與兩極間的邊線垂直放于電泳槽內電泳，4～5V/cm電泳至DNA貼緊袋壁。

(4)取出透析袋，擠出凝膠塊，吸出袋內液體放入1.5ml的離心管內，10000rpm離心5min。

(5)吸出上清放入離心管內，加入等體積的飽和酚和等體積的氯仿，振蕩混勻，10000rpm離心5min，吸出上清放入新的離心管內。

(6)加入1/10體積的3mol/L AaAc,2倍體積預冷的無水乙醇，于-20℃放置4～5h。

(7)于4℃，10000rpm離心15min，棄上清。

(8)用75%的酒精洗滌2次，每次均于4℃，10000rpm離心5min，棄上清。

(9)真空抽干，并用適量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。