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當前位置：上海士鋒生物科技有限公司>>公司動態>>提高質粒DNA的轉化效率的幾個重要因素
為了提高轉化效率, 實驗中要考慮以下幾個重要因素：
1. 細胞生長狀態和密度: 不要用經過多次轉接或儲于4℃的培養菌，從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生時為好，可通過監測培養液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時,細胞密度在5×107 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。
2. 質粒的質量和濃度: 用于轉化的質粒dna應主要是超螺旋態DNA(cccDNA)。轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%。
3. 試劑的質量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是zui高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,分裝保存于干燥的冷暗處。
4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等是新的,并經高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。 本實驗以E.coli DH菌株為受體細胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態,然后與pBS質粒共保溫,實現轉化。由于pBS質粒帶有氨芐抗性基因(Ampr )，可通過Amp抗性來篩選轉化子。如受體細胞沒有轉入pBS，則在含Amp的培養基上不能生長。能在Amp培養基上生長的受體細胞(轉化子)肯定已導入了pBS。轉化子擴增后，可將轉化的質粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。 本實驗以E.coli DH菌株為受體細胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態,然后與pBS質粒共保溫,實現轉化。由于pBS質粒帶有氨芐抗性基因(Ampr )，可通過Amp抗性來篩選轉化子。如受體細胞沒有轉入pBS，則在含Amp的培養基上不能生長。能在Amp培養基上生長的受體細胞(轉化子)肯定已導入了pBS。轉化子擴增后，可將轉化的質粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。
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