1 實(shí)時(shí)定量RT - PCR的原理、方法和應(yīng)用
1. 1 實(shí)時(shí)定量RT - PCR的原理
實(shí)時(shí)定量pcr的發(fā)明歸功于兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn):一是發(fā)現(xiàn)DNA Taq酶有5′ 3′外切酶活性,二是利用熒光能量傳遞技術(shù)構(gòu)建了雙標(biāo)記寡核苷酸探針,即TaqMan探針。在PCR過程中,這些熒光信號可以被探測器所“即時(shí)”捕獲,電腦軟件可以通過等式ΔRn = R+n - R-n 計(jì)算ΔRn ,其中, R+n 是表示每點(diǎn)測量的熒光強(qiáng)度, R-n 表示熒光基線強(qiáng)度,ΔRn 的值表示PCR過程中,探針降解的量,就是PCR產(chǎn)物的量[ 3 ] 。以ΔRn的值對循環(huán)數(shù)作曲線,選擇一個(gè)熒光閾值,熒光達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù)叫做閾值循環(huán)數(shù)(Cycle Threshold,Ct ) ,而Ct 值隨這些起始模板量的增加而線性降低,從而可以通過Ct 值推算起始模板量。該方法的特異性由引物和探針的特異性所決定,只有在PCR過程中,探針退火到目標(biāo)片段才能發(fā)出熒光信號。
SYBR Green I是一種DNA結(jié)合染料,能非特異地?fù)饺氲诫p鏈DNA中去,在游離狀態(tài)下,它不發(fā)出熒光,但一旦結(jié)合到雙鏈DNA中以后,便可發(fā)出熒光,可以與任意引物、模板相配合,用于任意反應(yīng)體系中,因此,在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi),其信號強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。它的缺點(diǎn)是能與非特異性雙鏈DNA(如引物二聚體)結(jié)合,但其產(chǎn)生的干擾可通過熔解曲線分析得到解決[ 4 ] 。
分子信標(biāo)(molecular Beacons) ,是一種單鏈DNA形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu),在其一端有一報(bào)告基團(tuán),在另一端有淬滅基團(tuán),當(dāng)它形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí),由于熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互靠近,兩者之間發(fā)生熒光信號能量共振轉(zhuǎn)移( FRET) ,當(dāng)熱循環(huán)溫度達(dá)到分子信標(biāo)的解鏈溫度時(shí),其構(gòu)象發(fā)生改變,能與模板結(jié)合而*伸展成線性分子,使得FRET消失,報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光信號。
Amp liSensor技術(shù):該技術(shù)與Taqman PCR的區(qū)別在于其采用的是復(fù)合探針。一個(gè)探針上標(biāo)以熒光報(bào)告基團(tuán),另一個(gè)探針上標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán),后者的5′端較前者多出7個(gè)堿基(GCGTCCC) 。兩探針之間能因堿基互補(bǔ)而結(jié)合,此時(shí),兩基團(tuán)靠近而形成FRET結(jié)構(gòu),報(bào)告基團(tuán)的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收。當(dāng)兩探針分開后,其間的FRET關(guān)系受到破壞,淬滅基團(tuán)的抑制作用解除,報(bào)告基團(tuán)的熒光信號得到釋放。在PCR擴(kuò)增前需將該復(fù)合探針與一個(gè)半套式PCR引物連接,該引物的5′端應(yīng)具有一段與長探針上多出的7個(gè)堿基互補(bǔ)的序列,以便DNA連接酶能將該引物與短探針連接,擴(kuò)增時(shí),該探針- 引物復(fù)合物作為半套式引物摻入到模板,并釋放出淬滅探針,使原有的FRET結(jié)構(gòu)破壞,從而釋放出報(bào)告基團(tuán)的熒光信號,其強(qiáng)度與被擴(kuò)增的模板數(shù)相對應(yīng)[ 5 ] 。
L ightcycle技術(shù):該技術(shù)的特點(diǎn)也是將熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分別標(biāo)記在兩個(gè)不同的探針上,形成熒光探針和淬滅探針。熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記探針的5′端,熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記探針的3′端,兩探針能分別與模板同一條鏈中相鄰的核苷酸序列進(jìn)行雜交。當(dāng)探針游離時(shí)能檢測到報(bào)告基團(tuán)的熒光信號,如果反應(yīng)體系中存在特異性模板, PCR復(fù)性階段兩探針即會與之雜交,此時(shí)兩探針上的熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相距較近,形成FRET關(guān)系,前者的熒光信號被后者吸收,即發(fā)生熒光淬滅。由于熒光淬滅的程度與被擴(kuò)增的模板量相對應(yīng),可達(dá)到定量目的[ 5 ] 。
Comp lex探針技術(shù):該技術(shù)的特點(diǎn)是先合成熒光探針和淬滅探針,熒光探針為25個(gè)堿基左右, 5′端有熒光報(bào)告基團(tuán),淬滅探針長度為15個(gè)堿基左右, 3′端有熒光淬滅基團(tuán),并能與熒光探針5′端雜交。當(dāng)熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)靠近時(shí),熒光信號被吸收。當(dāng)反應(yīng)體系中沒有特異性模板時(shí),不能檢測到報(bào)告基團(tuán)的熒光信號。當(dāng)有特異性模板存在時(shí),在PCR復(fù)性階段熒光探針優(yōu)先與模板結(jié)合,以致兩探針分離,報(bào)告基團(tuán)的熒光信號可被釋放出來,其強(qiáng)度與被擴(kuò)增的模板數(shù)量成正比,因而可進(jìn)行PCR定量[ 5 ] 。
1. 2 方法
首先提取細(xì)胞因子mRNA,合成cDNA,可以采用TR Izol試劑盒,也可以采用Higher Pure RNA isolationkit從組織中提取RNA,所得到的RNA必須有較高的純度,且不含DNA;然后,確定管家基因,設(shè)計(jì)引物和探針;再進(jìn)行PCR擴(kuò)增和基因定量。