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動物基因組DNA/RNA提取及含量測定

時間:2015-10-26閱讀:911
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實驗原理
核酸和蛋白質是構成生物有機體的主要成分;核酸是生命的zui基本物質。在生物體中它們結合成核蛋白的形式存在。核酸按其化學組成可以分成兩大類,一類含D-2-脫氧核糖的稱為脫氧核糖核酸(DNA),主要存在于細胞核中;另一類含D-核糖的稱為核糖核酸(RNA),主要存在于細胞質內;由于核酸極不穩定,在較劇烈的化學。物理因素和酶的作用下很易降解,因此在制備時應防止過酸、過堿及其它引起核酸降解的因素作用。在提取中為防止組織中廣泛存在的核酸酶降解的作用,應在低溫下進行,必要時加入抑制劑,如檸檬酸鹽、氟化鈉、砷酸鹽等,皂土也可抑制DNA酶的活性,如果采用(SDS)或作蛋白質變性劑來分離核酸,它們同時也可以使核酸降解酶破壞,因此常獲得較好的效果

一、RNA的提取與測定
由于RNA的種類來源很多,因而提取制備方法各異,一般有法,去污劑法和鹽酸胍法,其中法實驗室zui常用。組織勻漿后用處理離心,RNA即溶于上層被酚飽和的水相中,向水相加冷乙醇后, RNA即以白色絮狀沉淀析出。此法較好除去DNA和蛋白質,且獲得生物活性的RNA。
工業上常用稀堿和濃鹽酸法提RNA,用這兩種方法提取的核酸均為變性RNA。主要用于制備核苷酸的原料。其工藝較簡單,濃鹽法是用10%氯化鈉的溶液,在90攝氏度提取3—4小時,冷卻,離心,上清液乙醇沉淀RNA。稀堿法用0.2%氫氧化鈉是酵母裂解,然后酸中和,除蛋白和菌體,上清液乙醇沉淀的RNA ,或調核酸等電點PI2.5沉淀。 
RNA廣泛存在啤酒酵母,面包酵母,酒精酵母和各種動物組織中。 
本實驗用動物肝臟經組織搗碎,制成組織勻漿,用0.14mol/L氯化鈉溶液提取。把細胞之中的核糖核蛋白提取出來,留下含有DNA的細胞核物質,調節PH4.5再將RNA和蛋白質分開,因為在0.14mol/L氯化鈉溶液中,RNA-蛋白溶解度大。DNA-蛋白溶解度低,而在1mol/L氯化鈉溶液中溶解度zui大。

RNA含量測定
RNA含量的測定方法很多:紫外吸收法、定磷法、常用地衣酚測定其原理是:當RNA與濃鹽酸共熱時,即可發生降解,形成核糖繼而轉變成糠醛,后者與3.5-二羥基甲苯(地衣酚)反應,在鐵或銅離子催化下,生成鮮綠色復合物,反應在670nm處有zui大吸收峰,RNA濃度在10-100μg/ml范圍內,光吸收與RNA濃度成正比,地衣酚特異性差,凡戊糖均有些反應。

試劑和器材
材料:動物肝臟
試劑:
0.14mol/L氯化鈉
標準RNA溶液: 100μg/ml
地衣酚試劑(現用現配)
80%溶液
95%乙醇
器材:勻漿器、離心機、分光光度計、燒杯、量筒等

操作方法
RNA提取:
勻漿:稱取3克牛肝剪碎,加20ml 0.14mol/L氯化鈉溶液10000rn/min左右勻漿1分鐘左右
離心:勻漿后溶液離心8000 rn/min離心7分鐘,量取上清液毫升數,沉淀物留做提取DNA用
除雜質:加等體積80%酚溶液于上清液中,攪拌充分混合10-20分鐘,置冰箱冷卻靜止30-40分鐘,離心取上層水相含有RNA,棄下層酚相含蛋白質和DNA等雜質
沉淀RNA:取上層水相含RNA溶液,加入2倍體積95%冷乙醇,攪拌,充分混合,置冰箱中冷卻,至出現白色絮狀物-RNA,離心8000 rn/min離心7分鐘,取沉淀物
溶解:用少量去離子水(約4毫升)溶解沉淀物,用以測定其含量

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