一個完整的基因芯片實驗包括以下幾個步驟：研究課題的提出、芯片設計、樣品制備、雜交反應、數據分析和處理。本文主要介紹其中的樣品制備(細胞標本采集和組織標本采集)的建議做法。

細胞標本采集操作建議規程

1. 所有樣品均應有樣品標簽(注明樣品編號)，同時有一張樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情況等。

2. 一張芯片實驗一般要求細胞數在1E+08，建議設計實驗和收獲細胞時可考慮多收集一些。

3. 貼壁與懸浮細胞培養誘導結束后，去除培養液，保留的細胞用PBS緩沖液洗一下，除去緩沖液，加溶液D*充分溶解細胞，放入液氮運輸。樣品量以實際得到的total RNA為準。

4. 血液：將白細胞分離出來，加溶液D充分溶解細胞，放入液氮運輸。樣品量以實際得到的total RNA為準。

5. 如果是細胞未經溶液D處理，直接凍入液氮罐(不)。工作人員會對細胞作相關處理，以便為細胞記數。

6. 以上提到的均是新鮮細胞，對一些已老化或質量不明的細胞，工作人員有權提出疑義，并要求退回或重新取樣。

不同組織抽提3-10μg mRNA所需組織量

器官/組織*     提取3μgmRNA所需組織量(克)     提取10μgmRNA所需織量(克)     總RNA得率[單位:毫克RNA/克組織]     mRNA所占百分比[%]
成人正常組織     肝     0.2083     0.6944     1.80 - 1.80 mg/g     0.80
成人正常組織     腦     缺數據     缺數據     1.30 - 1.30 mg/g     缺數據
成人正常組織     肺     0.3000     1.0000     1.00 - 1.00 mg/g     1.00
成人正常組織     心     0.5000     1.6667     0.60 - 0.60 mg/g     1.00
成人正常組織     胃     0.1852     0.6173     2.70 - 2.70 mg/g     0.60
成人正常組織     喉     0.3125     1.0417     1.20 - 1.20 mg/g     0.80
病理組織     結腸癌     0.2521     0.8403     1.70 - 1.70 mg/g     0.70
病理組織     胃癌     0.4317     1.4388     0.50 - 0.50 mg/g     1.39
病理組織     空腸腺癌     0.3571     1.1905     1.40 - 1.40 mg/g     0.60
病理組織     直腸癌     0.1604     0.5348     1.70 - 1.70 mg/g     1.10
病理組織     肝癌     0.1116     0.3720     3.84 - 3.84 mg/g     0.70
病理組織     肺癌     0.1282     0.4274     2.00 - 2.00 mg/g     1.17
考慮到個體差異以及樣品在研磨、勻漿等過程中的損失，客戶提供的樣品量應在上述基礎上增加1-2倍。

組織標本采集操作建議規程

鋁箔     經DEPC水浸泡過夜，78°C烘干，高壓滅菌后烘干
1.5 ml 微離心管
15 ml 聚丙烯離心管     市場有售RNAase-Free的相應規格離心管
標簽紙    
記號筆    
樣品登記表     由客戶專人填寫
液氮罐     應常備液氮罐，并保證液氮的來源
取材部位的病理切片     由客戶提供1-2張
注：

· 以下步驟1 - 5應在冰上進行且不超過15分鐘，超過時間會導致樣品的RNA降解。

· 對腫瘤組織的取材，要求盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，例如對于手術切除的整個或部分前列腺，可能要根據冰凍切片報告的結果來判定要進行研究的取材部位。

1. 離體新鮮組織，切成多個1cm3小塊，剔除結締組織和脂肪組織。胃、腸組織應剪除外膜;肝、腎、脾應剪除門部血管神經，腫瘤組織應將周圍的正常組織切除干凈(正常組織也應將周圍的腫瘤組織切除干凈)。

2. 在RNase-Free 0.9%生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。

3. 用鋁箔包裹組織，或用5ml凍存管裝載組織(但統一采用鋁箔)。用記號筆在鋁箔或凍存管外表寫明樣品編號，并貼上標簽，迅速投入液氮冷卻。

4. 填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情況等 。

5. 將液氮冷卻的組織放入樣品袋(每個樣品袋只保存同樣的組織)，袋口留一根編號繩，繩上粘一張標簽紙(標簽上注明：樣品名稱、編號、日期)，迅速轉入便攜式液氮罐。

6. 保留1-2張取材部位的病理切片。

基因芯片樣品的制備要點：

1.目的DNA的選擇對于大規模地研究基因表達問題，需要分析每一個基因的表達。因此，選擇的目的DNA必須能夠代表要研究的各個基因。對于整個基因組序列全部已知的生物，zui直接的方法是用PCR擴增基因組中每個已知的或預測的開放閱讀框架(openreadingframe)，亦可以選擇自己感興趣的部分序列。對于沒有測序，或只有部分測序的基因組，或者對于那些有大量內含子的基因組，上述方法就不現實。在這種情況下，我們首先考慮采用表達序列標記(EsT)。可以將單個EST的cD一NA克隆用作陣列DNA來源。對于還沒有基因組測序計劃或序列還未知的生物，可以利用cDNA文庫作為DNA來源。當然這種文庫是經歸整化處理過，以減少不必要的冗余。

用作陣列的DNA可以是雙鏈的，亦可以是單鏈的。但是其長度是小于開放閱讀框架，或小于1000bp的cDNA。這對于很多具有同源性的基因尤為重要。當基因之間具有很高同源性時，選擇基因之間有差異的部分，這樣便可以提高基因之間的分辨度。所以，在考慮每個基因代表性的同時，應充分考慮所研究問題的具體情況。

2.pcR擴增一般而言，100uLIPCR反應體系得到的產物足以點印：000個基因芯片。PcR通常是在96孔PCR儀上進行擴增。實際擴增的反應條件要根據所用的模板及引物來確定。但要盡量減少PCR反應體系中的組分，盡量只用模板、引物、核昔酸、Mg標準緩沖液和酶。不要用甘油或明膠，它們往往會粘附在陣列塊上而影響以后的點樣工作。

3.點樣前DNA準備點樣以前，要將pcR產物清洗純化干凈，并且對DNA進行一些處理，一般用異丙醇沉淀PCR產物，以除去酶、離子及核昔酸等。沉淀后用70%乙醇院1次，再用95%乙醇洗1次，待*干燥后，將所沉淀DNA重溶在3xSSC中，其濃度掌握在100ny…左右、由于處理的樣本量很大，一般直接在96孔板上直接操作，可選用能夠配置96孔板的離心機(如SavantSpeedVacPlussC210A)。當把DNA溶于10～15tL13XSSC(pH7.0)中后，置于4”C至少12h。然后，將DNA溶液封存在一20C～4”C。

除極個別特殊的樣品外，大多數的生物樣品不能與基因芯片反應。對此，應該對樣品進行提取擴增獲取其中的目的蛋白質或基因，然后標記，可提高檢測的靈敏度和實驗操作人員的安全性。