在逆境條件下(旱、鹽堿、熱、冷、凍),植物體內(proline,Pro)的含量顯著增加。植物體內含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,抗旱性強的品種往往積累較多的。因此測定含量可以作為抗旱育種的生理指標。另外,由于親水性*,能穩定原生質膠體及組織內的代謝過程,因而能降低冰點,有防止細胞脫水的作用。在低溫條件下,植物組織中增加,可提高植物的抗寒性,因此,亦可作為抗寒育種的生理指標。
一、原理
用磺基水楊酸提取植物樣品時,便游離于磺基水楊酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加熱處理后,溶液即成紅色,再用甲苯處理,則色素全部轉移至甲苯中,色素的深淺即表示含量的高低。在520nm波長下比色,從標準曲線上查出(或用回歸方程計算)的含量。
二、材料、儀器設備及試劑
(一)材料:待測植物(水稻、小麥、玉米、高粱、大豆等)葉片。
(二)儀器設備:1. 722型分光光度計;2. 研缽;3. 100ml小燒杯;4. 容量瓶;5. 大試管;6. 普通試管;7. 移液管;8. 注射器;9. 水浴鍋;10. 漏斗;11. 漏斗架;12. 濾紙;13 剪刀。
(三)試劑1. 酸性茚三酮溶液:將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中,攪拌加熱(70℃)溶解,貯于冰箱中;2. 3%磺基水楊酸:3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml;3. 冰醋酸;4. 甲苯。
三、實驗步驟
1. 標準曲線的繪制(1)在分析天平上稱取25mg,倒入小燒杯內,用少量蒸餾水溶解,然后倒入250ml容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度,此標準液中每ml含100μg。(2)系列濃度的配制取6個50ml容量瓶,分別盛入原液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5及3.0ml,用蒸餾水定容至刻度,搖勻,各瓶的濃度分別為1,2,3,4,5及6μg/ml。(3)取6支試管,分別吸取2ml系列標準濃度的溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液,每管在沸水浴中加熱30min。(4)冷卻后各試管準確加入4ml甲苯,振蕩30S,靜置片刻,使色素全部轉至甲苯溶液。(5)用注射器輕輕吸取各管上層甲苯溶液至比色杯中,以甲苯溶液為空白對照,于520nm波長處進行比色。(6)標準曲線的繪制:先求出吸光度值(Y)依濃度(X)而變的回歸方程式,再按回歸方程式繪制標準曲線,計算2ml測定液中的含量(μg/2ml)。
2. 樣品的測定(1)的提取:準確稱取不同處理的待測植物葉片各0.5g,分別置大管中,然后向各管分別加入5ml3%的磺基水楊酸溶液,在沸水浴中提取10min,(提取過程中要經常搖動),冷卻后過濾于干凈的試管中,濾液即為的提取液。(2)吸取2ml提取液于另一干凈的帶玻塞試管中,加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮試劑,在沸水浴中加熱30min,溶液即呈紅色。(3)冷卻后加入4ml甲苯,搖蕩30S,靜置片刻,取上層液至10ml離心管中,在3000rpm下離心5min。(4)用吸管輕輕吸取上層紅色甲苯溶液于比色杯中,以甲苯為空白對照,在分光光度計上520nm波長處比色,求得吸光度值。
四、結果計算根據回歸方程計算出(或從標準曲線上查出)2ml測定液中的含量(Xμg/2ml),然后計算樣品中含量的百分數。計算公式如下:
含量(μg/g)=