影響E.coli 中蛋白表達量的因素除載體啟動子結構以外,還有 質粒拷貝數、質粒穩定性、mRNA結構、密碼子的偏愛性和宿主菌的生長狀態等因素[58].由于 Vector NTI suitor7.0軟件模擬表達,可知mRNA結構和密碼子的偏愛性兩個影響因素不會造成表達困難,所以本實驗的工作主要針對載體拷貝數、載體穩定和宿主菌的生長狀態.

本實驗中重組表達質粒PrP-pET-32a（+）不穩定的原因可能是PrP對E.coli BL21（DE3）具有細胞毒性.pET-32a（+）來源于pBR-322,pBR-322源于ColE1.ColE1、pBR-322 、pET- 32a（+）都失去了分配功能區par.而天然質粒具有功能區par,可以保證質粒在每次細胞周期中準確的進行分離,并均等的分配到子代細胞中去.功能區 par對質粒PrP-pET-32a（+）的穩定性是*的[4].缺少功能區par的pET-32a（+）質粒在每次細胞周期中隨機分配到子代細胞中去,無細胞毒性時約98% E.coli BL21（DE3）會帶有質粒（見《pET System Manual》34頁）.表達有細胞毒性蛋白的E.coli BL21（DE3）不具有生長優勢,而且隨細菌培養時間的增加β-內酰氨酶將逐漸釋放到溶液中去,破壞溶液中的AMP.【β-內酰氨酶功能強大,細菌培養稀釋1000倍以后還能破壞幾乎所有的AMP（見《pET System Manual》33頁）】.這樣本不具有生長優勢的表達菌又失去了選擇壓力,造成大部分新生細菌無質粒,表現為表達困難.本實驗證實約60%以上的細菌無質粒.

鑒于以上原因,本實驗將融合蛋白Trx-PrPC 27-30表達分成兩個階段,前一個階段為質粒生長階段,主要保證質粒的穩定性和提高質粒的拷貝數;后一個階段為融合蛋白表達階段,待細菌生長達飽和以后,誘導融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達.

在溫度、AMP濃度、培養基等諸多影響質粒PrP-pET-32a（+）穩定性的因素中,以溫度影響zui為明顯.實驗結果顯示,37℃條件下約60% 以上的細菌無質粒PrP-pET-32a（+）,25℃條件下失去質粒PrP-pET-32a（+）的細菌在約10%以內.其他條件不變,AMP濃度在 100 ug/ml以上細菌質粒PrP-pET-32a（+）基本穩定.隨AMP濃度增加平板上的菌落逐漸變小,表明AMP可抑制細菌生長.不同培養基對 PrP-pET-32a（+）的穩定性無明顯影響,但TB培養基可提高蛋白表達量.實驗發現TB培養基比LB提高蛋白表達量約在5-10%之間.

本實驗中PrP-pET-32a（+）穩定性高則融合蛋白Trx-PrPC 27-30表達量高.

溫度因素是影響本實驗融合蛋白表達量zui為明顯的因素.如圖2-9,37℃條件下,其他條件不管如何改變,都未見融合蛋白Trx-PrPC 27-30有明顯表達帶ColE1復制起點的質粒,在加入以后可以抑制細菌蛋白的生長,但不抑制質粒拷貝數的增加.雖然沒有文獻可以解釋這一現象,我們仍可以推測導致質粒拷貝數增加的蛋白合成系統是獨立于細菌蛋白合成系統的,這個系統以一種相對穩定速度合成質粒.所以降低細菌生長速度可增加細菌質粒拷貝數（并間接增加質粒穩定性）從而增加融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達量.本實驗在37℃條件下,誘導前OD600 為0.6時開始誘導,4 h誘導培養 ,菌液的OD600 值可達5,未見融合蛋白Trx-PrPC27-30的明顯表達;25℃條件下,誘導前OD600 為1.5,更換等體積新鮮TB誘導4h,菌液的OD600 值可達2.3,融合蛋白Trx-PrPC27-30的zui高表達量接近50%.變化如此之大,出乎意料.

AMP濃度是繼溫度條件以后,影響融合蛋白表達量的另一個重要因素.當其他條件不變,AMP濃度在50 ug/ml以下時,融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達量在20%以下;AMP濃度在200-500 ug/ml條件下,Trx-PrPC 27-30呈高表達,表達量接近50%.但AMP濃度加到500 ug/mlAMP時則會使細菌的生長速度下降.說明一定的選擇壓力可以提高質粒的穩定性從而提高融合蛋白表達量,200 ug/ml的AMP濃度為zui適表達濃度.

不同IPTG濃度對融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達量無明顯影響,0.1 mM的IPTG即可達到38%的表達量,1 mM IPTG可達zui高表達量;乳糖誘導條件下融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達量隨乳糖濃度增加而逐漸增加,但乳糖誘導融合蛋白Trx-PrPC27-30的zui高表達量（39.6%）比IPTG誘導的zui高表達量（45.7%）低.可能是由于乳糖提高了細菌的生長速度,間接降低了質粒的拷貝數,導致表達量下降.乳糖濃度太低時,細菌在誘導表達早期已將乳糖消耗干凈,造成誘導不足;乳糖濃度太高,細菌的生長速度過快,降低了質粒的拷貝數,融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達量又有所下降.所以乳糖誘導表現為融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達量,隨乳糖濃度增加由低到高,然后又略有下降.當其他條件不變時,用3%乳糖誘導融合蛋白Trx-PrPC 27-30可達zui高表達量,而8%乳糖誘導表達量有所下降.

隨誘導時間的增加融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達量均勻增加,3 h以后接近zui高表達量,過夜誘導zui高表達量可達47%,甚至接近50%.誘導過程中細菌OD600 變化不大,由1.5上升為2.0-2.5.與此不同的是,37℃誘導條件下,無融合蛋白Trx-PrPC 27-30表達時,細菌OD600 值變化很大,誘導4 h,細菌OD600 值由0.6上升為5,表明細菌分裂并不是表達融合蛋白所需,甚至可導致蛋白表達量下降.細菌生長接近飽和以后,更換等體積新鮮培養基誘導,可獲得高的蛋白表達量.