一、目的

了解常用簡易保藏法的原理，掌握其操作方法。

二、原理

常用簡易保藏法包括斜面低溫保藏法、半固體穿刺保藏法、液體石蠟保藏法、甘油保藏法，沙上管保藏法等。由一這此保藏方法只需要特殊設備，操作簡便易行，故為一般實驗空及生產(chǎn)單位所廣泛采用。

斜面低溫保藏法和半固體穿刺保藏法是將在斜面或半固體培養(yǎng)基上己生長好的培養(yǎng)物置于4~5℃冰箱屮保藏。這兩種方法都是利用低溫抑制微生物的生長繁殖，從而延長保藏時間。

液體石蠟保藏是在新鮮的斜面培養(yǎng)物上，覆蓋一層經(jīng)過滅菌的液體石蠟，再置于4~5℃冰箱中保藏。液體石蠟主要起隔絕空氣作用，故此法是利用缺氧低溫雙重抑制微生物生長，從而延長保藏時間。

甘油保藏法是在液體的新鮮培養(yǎng)物中加入適量的經(jīng)過滅菌的甘油，然后再置于-20℃或-70℃冰箱中保藏。此法適用于甘油作為保護劑，甘油透入細胞后，能強烈降低細胞的脫水作用，同時在低溫條件下，可大大降低細胞代謝水平，達到延長保藏時間的目的。

沙土管保藏法是將待保藏菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后制成孢子懸液，將孢子懸液滴入已滅菌的沙土管中，孢子即吸附在沙子上，將沙土管置于真空干燥器中，吸干沙土管中水分，經(jīng)密封后至于-4℃冰箱中保藏。此法利用干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)、低溫等因素綜合抑制微生物生長繁殖，從而眼殘保藏時間。

三、材料

1.菌種  細菌、放線苗、酵母菌及霉菌。

2.培養(yǎng)基  肉膏蛋白胨斜面及半固體深層培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖斜面培養(yǎng)基、高氏一號斜面培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基。

3.其他  無菌液體石蠟、無菌甘油、帶螺口蓋和密封圈的無菌試管或1.5ml無菌Eppendorf管、100ml三角瓶。

四、方法與步驟

1.斜面低溫保藏法（適用于細菌、放線菌、酵母菌及霉菌的保藏〕將菌種接種在適宜的培養(yǎng)基斜面上，在適宜的溫度培養(yǎng)，使其充分生長。如果是能形成芽孢或孢子等休眠體的菌種，待形成芽孢成孢子等休眠體后再置于4~5℃冰箱中進行保藏。

不同種類的微生物有不同的保藏期，到期后需轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)適當培養(yǎng)后，再行保藏。此法優(yōu)點是操作簡便，不需要特殊設備；缺點是保藏時間短，菌種經(jīng)反復轉(zhuǎn)接后，遺傳性狀已發(fā)生變異，生理活性減退。各類微生物的培養(yǎng)條件見表14-1。

2.半固體穿刺保藏法（適用于兼性厭氧細菌或酵母菌的保藏）用穿剌接種法將菌
種接入半固體深層培養(yǎng)基*部分，注意不要穿透底部。在適宜的溫度培養(yǎng)，使其充分生長。培養(yǎng)好的菌種置于4-5℃冰箱保藏。一般保藏0.到1a后，需轉(zhuǎn)接到新的半固體深層培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后再行保藏。

3.液體石蠟保藏法<適用于真菌和放線菌保藏）

（1）無菌液體石蠟制備  將液體石蠟罝1于100ml的三角瓶內(nèi)，毎瓶裝10ml，塞上棉塞，外包牛皮紙、高壓蒸汽滅菌（0.1Mpa30min）。滅菌后將裝有液體石蠟的三角瓶置于105~110℃的烘箱內(nèi)約1h，以除去液體石蠟中的水分。

(2)接種、培養(yǎng)及保藏  將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，在適宜的溫度下培養(yǎng)，使其充分生長。用無菌吸管吸取無菌液體石蠟，注入到已生長好菌的斜面上，液體石蠟的用量以高出斜面頂端1cm左右為準，使菌種轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后加入適量滅菌液體石蠟，再行保藏。

4.甘油保藏法（常用于細菌保藏）

（1）無菌甘油制備  將甘油置于100ml的三角瓶中，每瓶裝10ml，塞上棉塞，外包牛皮紙，高壓蒸汽滅菌（0.1Mpa20min）。

⑵接種、培養(yǎng)及保藏  挑取一環(huán)菌種接入LB液體培養(yǎng)基試管中，37℃振蕩培養(yǎng)至充分生長。用吸管吸取0.85ml培養(yǎng)液，置于一只帶有螺口蓋和空氣密封圈的試管中或一支1.5ml的Eppendorf管中，再加入0.15ml無菌甘油，封口，振蕩混勻。然后將其置于乙醇-干冰或液氮中速凍。zui后將已冰凍的含有甘油的培養(yǎng)物置于-20~70℃保藏，保藏期為0.5~1a。

到期后，用接種環(huán)從凍結(jié)的表面刮去培養(yǎng)物，接種至LB斜面上，37℃培養(yǎng)48h。然后用接種環(huán)從斜面上挑取一環(huán)長好的培養(yǎng)物，置入裝油2mlLB培養(yǎng)液的試管中，再加入2ml含30%無菌甘油的LB液體培養(yǎng)基，振蕩混勻。zui后分裝于帶有螺口蓋和密封圈的無菌試管中或1.5的Eppendorf管中，按上述方法速凍保藏。

5.沙土管保藏法（適用于產(chǎn)孢子的芽孢桿菌、梭菌、放線菌和霉菌的保藏）

（1）無菌沙土管制備  取河沙若干，用40目篩子過篩，出去大的顆粒。再用10%HCL溶液浸泡2-4h除去有機雜質(zhì)，倒出鹽酸，用自來水從洗至中性，烘干。另取非耕作層瘦黃土若干，磨細，用100目篩子過篩。取1份制備的土加加4份沙混合均勻，裝入小試管中（如血清管大?。?。裝量約1cm高即可，塞上棉塞，0.1Mpa滅菌1h，每天一次，連續(xù)3d。

 （2）制備菌懸液  吸取3~5ml無菌水至一支已培養(yǎng)好的菌種斜面中，用接種環(huán)輕輕攪動培養(yǎng)物，使呈菌懸液。

 （3）加樣及干燥  用無菌吸管吸取菌懸液，在毎支沙土管中滴加4~5滴菌懸液，塞上棉塞，振蕩搖勻。將已滴加菌懸液的沙土管置于預先放有五氧化二磷或無水氯化鈣的干燥器內(nèi)。當五氧化二磷或無水氯化鈣因吸水變成糊狀時，則應進行更換。如此數(shù)次，沙土管即可干燥。也可用真空泵連續(xù)抽氣約3h，即可達到干燥效果。

 （4）抽樣檢查  從柚干的沙土管中，每10支抽取1支進行檢査。用接種環(huán)取少許沙土，接種到適合于所保藏菌種生長的斜面上，進行培養(yǎng)，觀察所保藏菌種的生長及有無雜菌生長情況。

（5）保藏  檢查合格后，可采用以下方法進行保藏：①沙土管繼續(xù)放入干燥器中，置于室溫或冰箱中。②將沙土管帶塞一端浸人熔化的石蠟中，密封管口。③在煤氣燈上，將沙土管的棉塞下端的玻璃燒熔.封住管口，再置4℃冰箱中保藏。此法可保截菌種1年到數(shù)年。

                表14-1各種微生物斜面培養(yǎng)條件及保藏期