分離細(xì)胞的檢測方案

概述

用密度為5×105到2×106個(gè)細(xì)胞/ mL的測試化合物制備細(xì)胞

將FAM-YVAD-FMK以1：150的比例加入到細(xì)胞溶液中

在室溫下孵育1小時(shí)

將細(xì)胞沉淀，用緩沖液或生長培養(yǎng)基洗滌并重懸細(xì)胞

在Ex / Em = 490 / 525nm處分析細(xì)胞

注：使用前將所有部件在室溫下解凍。

操作方法

1.根據(jù)您的特異性誘導(dǎo)方案，將細(xì)胞培養(yǎng)至適于細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的密度，但不超過2 x 106個(gè)細(xì)胞/ mL。同時(shí)，對(duì)于每種標(biāo)記條件，以與誘導(dǎo)群體相同的密度培養(yǎng)非誘導(dǎo)的陰性對(duì)照細(xì)胞群。以下是一些誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞凋亡的例子：

1）用2μg/ ml喜shu堿處理Jurkat細(xì)胞3小時(shí)。

2）用1μM星形孢菌素處理Jurkat細(xì)胞3小時(shí)。

3）用4μg/ ml喜shu堿處理HL-60細(xì)胞4小時(shí)。

4）用1μM星形孢菌素處理HL-60細(xì)胞4小時(shí)。

注意：應(yīng)對(duì)每個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行單獨(dú)評(píng)估，以確定誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞密度。

2.通過向FAM-YVAD-FMK（組分A）的小瓶中加入50μLDMSO制備150X FAM-YVAD-FMK DMSO儲(chǔ)備溶液。

3.將150×FAM-YVAD-FMK DMSO儲(chǔ)備溶液（來自步驟1）以1：150的比例添加到細(xì)胞溶液中，并將細(xì)胞在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。

注1：對(duì)于FAM-YVAD-FMK標(biāo)記，細(xì)胞可以濃縮至~5×10 6個(gè)細(xì)胞/ mL。 未使用的150X FAM-YVAD-FMK DMSO儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20°C。

注2：對(duì)于粘附細(xì)胞，用0.5mM EDTA輕輕提起細(xì)胞以保持細(xì)胞完整，并在用FAM-YVAD-FMK孵育之前用含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。

注3：適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間取決于所用的細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度。 優(yōu)化每個(gè)實(shí)驗(yàn)的孵育時(shí)間。

4.將細(xì)胞以約200g旋轉(zhuǎn)5分鐘，并用1mL洗滌緩沖液（組分B）洗滌細(xì)胞兩次。 將細(xì)胞重懸于所需量的洗滌緩沖液中。

注1：FAM-YVAD-FMK是熒光的，因此清除任何未結(jié)合的試劑以消除背景非常重要。

注2：對(duì)于分離的細(xì)胞，應(yīng)將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至每個(gè)微量滴定板孔中2-5×10 5個(gè)細(xì)胞/100μL等分試樣，用于步驟6。

5.如果需要，用DNA染色標(biāo)記細(xì)胞（如用于死細(xì)胞的碘化丙錠，或用于細(xì)胞核染色的整個(gè)群體的Hoechst）。

6.通過熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 490 / 525nm處檢測熒光強(qiáng)度（對(duì)于碘化丙錠，Ex / Em = 535/635 nm;對(duì)于Hoechst染料，Ex / Em = 350 / 461納米）。

6.1對(duì)于流式細(xì)胞儀，使用FL1通道監(jiān)測熒光強(qiáng)度（FL2通道用于碘化丙錠染色）。

6.2用于熒光顯微鏡和熒光酶標(biāo)儀。將100μL細(xì)胞懸浮液置于96孔黑壁/微量滴定板透明底部的每個(gè)孔中。

注意：如果需要平衡細(xì)胞濃度，調(diào)整誘導(dǎo)細(xì)胞的懸浮體積以接近非誘導(dǎo)細(xì)胞群的細(xì)胞密度。如果您的細(xì)胞治療不會(huì)導(dǎo)致受刺激細(xì)胞群數(shù)量的顯著損失，則此調(diào)整步驟是可選的。

6.3使用FITC通道在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞（用于碘化丙啶染色的TRITC通道，用于Hoechst染色的DAPI通道）。

6.4使用熒光酶標(biāo)儀，使用Ex / Em = 490 / 525nm（在515nm處截止）底部讀取模式監(jiān)測熒光強(qiáng)度。