Amplite NAD+/NADH檢測(cè)試劑盒（熒光法） 紅色熒光是AAT Bioquest研發(fā)的檢測(cè)NAD+/NADH的試劑盒。煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。NADH是NAD +的還原形式，NAD +是NADH的氧化形式。NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團(tuán)添加到腺苷核苷酸的2'位置。NADP用于合成代謝生物反應(yīng)，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作為還原劑。 在葉綠體中，NADP是在光合作用的初步反應(yīng)中重要的氧化劑。通過光合作用產(chǎn)生的NADPH用作卡爾文光合作用循環(huán)中生物合成反應(yīng)的還原能力。

傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測(cè)定通過監(jiān)測(cè)340nm處NADH或NADPH吸收的變化來進(jìn)行。 Amplite™熒光總NAD和NADH檢測(cè)試劑盒為敏感檢測(cè)NAD和NADH提供了一種便捷的方法。系統(tǒng)中的酶特異性識(shí)別酶循環(huán)反應(yīng)中的NAD / NADH，其顯著提高了檢測(cè)靈敏度。此外，該測(cè)定具有非常低的背景，因?yàn)槠湓诩t色可見范圍內(nèi)運(yùn)行，這顯著降低了生物樣品引起的干擾。該測(cè)定已證明在Ex / Em = 540 / 590nm處具有高靈敏度和低干擾。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NAD+/NADH檢測(cè)試劑盒（熒光法）。

Amplite™熒光總NAD和NADH分析試劑盒提供靈敏的一步法分析，可在100μL分析體積（100nM;圖1）中檢測(cè)少至10皮摩爾的NAD（H）。 該測(cè)定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進(jìn)行，并且容易適應(yīng)自動(dòng)化而無(wú)需分離步驟。 其信號(hào)可通過熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 530-570nm / 590-600nm（大Ex / Em = 540 / 590nm）或吸光度酶標(biāo)儀在~576nm處容易地讀取。

實(shí)驗(yàn)方案

96孔板測(cè)定示例

概述

準(zhǔn)備NAD / NADH反應(yīng)混合物（50μL）

添加NADH標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50μL）

在室溫下孵育15分鐘--2小時(shí)

監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光強(qiáng)度

操作方法

1.準(zhǔn)備NADH儲(chǔ)備溶液：

將200μLPBS緩沖液加入到NADH標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH儲(chǔ)備溶液。

注意：未使用的NADH儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。

2.準(zhǔn)備NAD / NADH反應(yīng)混合物：

將10mL NAD / NADH傳感器緩沖液（組分B）加入NAD / NADH再循環(huán)酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。

注意：NAD / NADH反應(yīng)混合物足以用于兩個(gè)96孔板。 未使用的NAD / NADH反應(yīng)混合物應(yīng)分成一次性等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。

3.準(zhǔn)備NADH標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋液（0至10μM）：

3.1將10μL的NADH儲(chǔ)備溶液（來自步驟1）加入到990L PBS緩沖液（pH 7.4）中，以產(chǎn)生10μM（10pmol / L）NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液。

注意：稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。

3.2取200μL10μMNADH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，得到NADH標(biāo)準(zhǔn)品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM連續(xù)稀釋液。

3.3如表1和2中所述，將含有NADH標(biāo)準(zhǔn)品和含NAD / NADH的測(cè)試樣品的系列稀釋液加入到固體黑色96孔微量培養(yǎng)板中。

注意：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。

表1實(shí)心黑色96孔微孔板中NADH標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局

注意：NS = NADH標(biāo)準(zhǔn)，BL =空白對(duì)照，TS =測(cè)試樣品。

表2.每個(gè)孔的試劑組成

注意：將連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品（0.01μM至10μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。 高濃度的NADH（例如，>100μM，終濃度）可能由于NADH傳感器（對(duì)非熒光產(chǎn)物）的過度氧化而導(dǎo)致熒光信號(hào)降低。

4.在上清液反應(yīng)中運(yùn)行NAD / NADH測(cè)定：

4.1將50μL的NADH反應(yīng)混合物（來自步驟2）加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品（來自步驟3.3）的每個(gè)孔中，使得總NADH測(cè)定體積為100μL/孔。

注意：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNADH反應(yīng)混合物。

4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時(shí)，避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)熒光增加。

注1：也可將板的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到白色透明底板上，用吸光度酶標(biāo)儀在576±5nm波長(zhǎng)下讀數(shù)。 與熒光讀數(shù)相比，吸收檢測(cè)具有較低的靈敏度。

注意2：對(duì)于NAD / NADH比率測(cè)量，建議使用試劑盒15263。

注意3：對(duì)于基于細(xì)胞的NAD / NADH測(cè)量，建議使用ReadiUse™哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解緩沖液* 5X *（目錄號(hào)20012）裂解細(xì)胞。