碘化丙啶的應用和常見問題

時間：2024/5/10閱讀：315

碘化丙啶（Propidium iodide）是一個小分子芳香化合物，通常在研究和開發中作為熒光核酸結合染料。PI通常用于區分活細胞與凋亡細胞和壞死細胞,因為它可以自由滲透死亡或損傷細胞膜,而不能進入正常活細胞。碘化丙啶能染色核酸，如DNA和RNA，因此可用作流式細胞儀、原位雜交和免疫組織化學應用中細胞膜完整性的指示劑。

在樣品中加入碘化丙啶后，細胞膜永J性或可逆性損傷的細胞將發出紅色熒光。通過這種方式，碘化丙啶能夠快速且可靠地識別和定量死亡和壞死細胞。碘化丙啶有助于確定整體細胞活性，這是用于監測細胞群體對細胞毒性藥物或其他環境因素的反應的重要參數。

活力研究通常包括使用碘化丙啶染色，搭配細胞凋亡標記染料（如Annexin V-FITC或發出明亮綠色熒光的iFluor® 488）。當一起使用時，可以獲得總細胞計數，并且可以觀察樣本中的細胞形態。例如，使用這兩種染色劑可以區分完整細胞（iFluor® 488-PI-）、早期凋亡細胞（iFluor® 488+PI-）和晚期凋亡或壞死細胞（iFluor® 488+PI+）。

碘化丙啶的應用和常見問題

碘化丙啶的化學結構

PI染色方案

用PI染色細胞的基本方法如下:

1. 細胞準備：將PI（碘化丙啶）溶解在PBS或Tris-EDTA緩沖液等緩沖溶液中。染色溶液中PI的濃度可能因實驗條件而異，但通常為1-5mg/ml。

2. 細胞培養：細胞從生長表面（例如培養皿）分離，粘附細胞使用胰D白酶處理，懸浮細胞使用離心。將多達1X10^6個細胞/100微升分裝到聚苯乙烯管中，并在輕輕渦旋的同時加入70%的乙醇。

3. 細胞清洗：向細胞添加2毫升PBS，以300 X g離心5分鐘，然后將緩沖液從沉積的細胞中倒出。重復此步驟共2次，以除去殘留的培養基或血清成分。

4. 細胞重懸：含有PI的染色溶液（例如，PBS中0.1%的BSA、RNase、PI儲備液）應加入到細胞懸液中，以達到所需的PI濃度。輕輕混合細胞和PI溶液以確保均勻染色。

5. 細胞孵育：根據實驗的需要，在37攝氏度下孵育細胞一段時間。通常在暗室中用PI孵育細胞超過30分鐘，以防止光照導致降解。

6. 分析細胞：孵育后，用PI染色的細胞可以使用流式細胞術進行分析，激光發出的光波長為488nm（藍綠色）來激發細胞。發出的熒光為紅色，波長為617nm。在免疫組織化學（IHC）中，PI常用作核染色劑，用于在組織切片中染色細胞核。

該方案應根據實驗要求和優化進行調整。

碘化丙啶的優點及常見問題

使用碘化丙啶染色技術的主要優點是這些方法幾乎不會導致細胞損耗，并且可以避免通過水解引起的細胞損傷。然而，使用碘化丙啶也存在一些常見的問題。傳統的Annexin V/PI方案以及類似的染色方案可能導致相當數量的假陽性事件（>40%）。這種假陽性與碘化丙啶也會染色細胞質內的RNA有關。這個問題可能出現在初代細胞和細胞系中，最常見于核質比較小的較大細胞。

由于碘化丙啶是一種不可穿透細胞膜的DNA染料，它通常與一種可穿透細胞膜的DNA染料一起用于細菌活性研究中。然而，在研究中，碘化丙啶對生物膜中貼壁細胞的染色已表現出明顯低于實際細菌活性的情況，這是由于細胞外核酸（eNA）的存在。觀察時，似乎會出現一層假死的紅色碘化丙啶染色細胞。這種情況有時會掩蓋一部分雙重染色的細胞，這些細胞內部是綠色的，表明其活性，而紅色層則表明DNA可能位于整個細胞膜之外。

因此，這類細胞群體的活力染色結果使用另一種估計活力的方法進行驗證，例如，共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）或熒光顯微鏡。在大多數情況下，碘化丙啶的使用限于固定或滲透的細胞，如果遇到活細胞則會被活細胞主動排出的細胞中。在滲透和固定過程中，通常選擇使用醇類或醛類試劑。重要的是，醛和醇通常與熒光蛋白和某些表面標記不兼容，因此對苯甲醛可能是更合適的選擇。就安全性而言，碘化丙啶是一種疑似致癌物質，可能引起皮膚、眼睛和呼吸系統刺激。

碘化丙啶的應用和常見問題

研究了流體剪切力（FSS）對腎小管細胞中凋亡和壞死的影響。HK-2細胞的密集單層在靜態條件（FSS 0）或0.5 Pa流體剪切應力（FSS 0.5）下培養48小時。A/細胞先用Annexin-V染色，然后立即通過流式細胞術分析磷脂酰絲an酸的外翻（Annexin-V熒光，X軸）和碘化丙啶（PI）的攝取（PI熒光，Y軸）。通過Annexin-V-/PI-（左下象限）、Annexin-V+/PI-（右下象限）和Annexin-V+/PI+（右上象限）的標準區分活細胞、早期凋亡細胞或壞死細胞（初級或次級）。B/早期凋亡和壞死細胞的比例進行了量化，結果以細胞總群體的百分比表示。數據表示7次實驗的平均值 ± SEM。*HK-2細胞使用Cell Meter Annexin V Binding Apoptosis Assay Kit根據制造商的指示評估凋亡和壞死。

產品

表1.Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒選擇指南

產品名稱	貨號	Ex/Em	規格
Cell Meter PE-Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒適用于流式細胞儀	22838	565/575nm	100 Tests
Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒橙色熒光 405nm激發	22830	527/550nm	100 Tests
Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒綠色熒光 405nm激發	22829	410/501nm	100 Tests
Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒藍色熒光 405nm激發	22828	406/445nm	100 Tests
Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒深紅色熒光適合流式細胞檢測	22827	656/670nm	100 Tests
Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒紅色熒光適合流式細胞檢測	22826	587/603nm	100 Tests
Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒橙色熒光適合流式細胞檢測	22825	557/570nm	100 Tests
Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒綠色熒光適合流式細胞檢測	22824	491/516nm	100 Tests
Cell Meter FITC-Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒適合于流式細胞儀	22839	491/516nm	100 Tests
Cell Meter APC-Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒適合于流式細胞儀	22837	651/660nm	100 Tests

表2.在死細胞和固定細胞中，用核酸染色標記細胞核

產品名稱	貨號	Ex/Em	規格
核藍DCS1死細胞染料	17548	348/469nm	0.5mL
死細胞核染料DiTO-15mM DMSO溶液相當于TOTO-1	17575	514/531nm	0.2ml
核綠DCS1死細胞染料	17550	503/527nm	0.5mL
核綠DCS1光固定型死細胞核染料	17570	502/527nm	1mg
死細胞核染料TWO-PRO1相當于TO-PRO1	17571	515/531nm	0.2mL
核橙DCS1死細胞染料	17551	514/556nm	0.5mL
碘化丙錠PI	17516	537/618nm	5g
碘化丙錠PI10mM水溶液	17517	537/618nm	1mL
死細胞核染料DiYO-1 相當于YOYO1*5 mM DMSO Solution	17580	491/508	0.2mL

表3.Live or Dead細胞活性檢測試劑盒

產品名稱	貨號	Ex/Em	規格
Live or Dead細胞活性檢測試劑盒綠色/紅色雙熒光	22789	494/514 537/618	200Tests
Live or Dead細胞活性檢測試劑盒綠色/紅色雙熒光	22760	494/514 537/618	1000Tests
Live or Dead細胞活性檢測試劑盒紅/藍雙色熒光	22788	613/631 348/469	200Tests

表4.

MycoLight熒光活/死細菌成像試劑盒

產品名稱

貨號

Ex/Em

Em顏色

規格

MycoLight熒光活/死細菌成像試劑盒

22411

488/530

537/618

綠（活）

紅（死）

100Tests

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