百螢生物為您總結(jié)的關(guān)于鈣黃綠素實(shí)驗中可能會遇到的相關(guān)問題
1.鈣黃綠素產(chǎn)品的用途是什么？
答：鈣黃綠素是用來標(biāo)記和監(jiān)測活細(xì)胞的細(xì)胞功能的一類熒光探針/試劑盒。它只針對活細(xì)胞進(jìn)行染色，不能染已固定的細(xì)胞。
注：染色時間不可太久，保持在內(nèi)，后，熒光會變得不明顯。
2.鈣黃綠素中帶AM與不帶AM的探針有什么區(qū)別？它們的優(yōu)點(diǎn)是什么？
答：不帶AM的探針可以直接注射進(jìn)入細(xì)胞，而帶AM的探針，因為AM 具有細(xì)胞膜滲透性，一旦進(jìn)入細(xì)胞，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解為鈣黃綠素(Calcein)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的綠色熒光(Ex/Em= 490nm/515nm)。因不具細(xì)胞膜滲透性，從而能被保留在細(xì)胞內(nèi)。Calcein Red和Calcein Deep Red兩種類似物，使其能夠替代Calcein AM用在活細(xì)胞的標(biāo)記和功能分析的多重標(biāo)記研究。AM酯是非極性酯，其易于穿過活細(xì)胞膜，并且通過活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶快速水解。AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針加載到活細(xì)胞中。但是，使用AM酯時必須小心，因為它們易于水解，特別是在溶液中。它們應(yīng)在使用前重新配制成高質(zhì)量的無水二甲基亞砜(DMSO)。DMSO儲備溶液可以在-20℃下干燥儲存并避光。在這些條件下，AM酯可以穩(wěn)定數(shù)個月。
3.鈣黃綠素的染色過程需要注意哪些問題？
答：細(xì)胞離心，去培養(yǎng)基，清洗細(xì)胞1~2次，以充分去除殘留的培養(yǎng)基，稀釋成工作濃度為2-5μM (PBS 或 HBSS-HEPES) 有時可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein Red ™儲存液內(nèi)來增強(qiáng)其水溶性37℃ 孵育20min～1h用PBS(或者其他緩沖液)洗滌細(xì)胞兩次去除多余染料。
注：1.細(xì)胞活力理想的濃度范圍應(yīng)在4-5μM
2.如果細(xì)胞中含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入丙H舒(1-2.5 mM)或磺吡酮(0.1-0.25 mM)，以減少脫酯化。
3.因為背景高的原因，需要多清洗細(xì)胞幾次去除多余染料。
4.鈣黃綠素適用于哪些儀器？
答：熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀
注：使用流式細(xì)胞儀時需要立即分析細(xì)胞樣品，以確定在零時間沒有洗滌的每個細(xì)胞的平均熒光。
5.鈣黃綠素與其他活細(xì)胞染料相比有何優(yōu)勢？
答：鈣黃綠素與其他同類產(chǎn)品(如CFDA、CFSE等)相比是特別適合染活細(xì)胞的熒光探針，因為它的毒性特別低。并且它不會抑制細(xì)胞的各種功能，如增殖、趨化性等。
注：鈣黃綠素和碘化丙啶(PI)常用于鑒別死活細(xì)胞。鈣黃綠素的親脂性很高，可以通過細(xì)胞膜，脫去AM后發(fā)生強(qiáng)烈綠色熒光；而碘化丙啶(PI)不能通過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，它僅可以穿過死細(xì)胞膜，嵌入其DNA螺旋產(chǎn)生紅色熒光。由于鈣黃綠素與碘化丙啶在490nm處均可被激發(fā)，545nm激發(fā)僅可觀察死細(xì)胞。因此，他們被用于活細(xì)胞和死細(xì)胞雙重染色。
6.鈣黃綠素在作為顯色劑時如何很好的溶解？
答：鈣黃綠素在在1mol/L的氫氧化鈉溶液中，溶解度能達(dá)到50mg，并且超聲助溶不會破壞其結(jié)構(gòu)。
