酵母雙雜交(Yeast Two Hybrid, Y2H)可分為核蛋白體系酵母雙雜交和膜蛋白體系酵母雙雜交，兩種體系大致原理相同。以下為大家分別介紹：
 

　　1、核體系酵母雙雜交技術原理
 

　　核蛋白酵母雙雜交主要原理是基于酵母轉錄激活因子GAL4由兩個可以分開的、功能上相互獨立的結構域組成。其中N端的147個氨基酸組成GAL的DNA結合結構域(DNA binding domain, BD)，負責與基因上游的激活序列(upstream activating sequence, UAS)結合；C端的113個氨基酸組成GAL的轉錄激活結構域(transcription activation domain,AD)，負責激活UAS下游的基因轉錄過程。BD與AD在單獨存在時無法激活UAS下游基因轉錄，只有當BD與AD在空間上接近時才能發揮完整的轉錄因子功能，激活UAS下游基因的表達，使得菌落能夠在缺陷培養基中的生長情況或者通過顯色反應進行顯色。例如當報告基因為LacZ時，在培養基中加入顯色底物X-Gal，當BD與AD同時存在時，LacZ正常表達，生成β-半乳糖苷酶，將X-Gal切割成半乳糖和深藍色的底物5-溴-4氯靛藍，使得菌落呈現藍色。
 

圖 酵母GAL4轉錄激活示意圖
 

　　在進行酵母雙雜實驗時，將已知的誘餌蛋白X與BD結構域融合表達；捕獲蛋白Y與AD結構域融合表達。若蛋白A和蛋白B存在互作，則BD和AD在空間上會靠近，成為有活性的轉錄激活因子，激活下游報告基因表達；若蛋白A和蛋白B不存在互作，則BD和AD在空間上較遠，單獨無法發揮轉錄激活作用，報告基因不表達。酵母文庫構建和篩選則是將捕獲蛋白更換為蛋白文庫，構建融合表達AD結構域的文庫質粒，并形成酵母文庫，從而利用酵母雙雜交系統篩選與誘餌蛋白A存在相互作用的未知蛋白。
 

圖酵母雙雜交原理示意圖
 

　　2、膜體系酵母雙雜交技術原理
 

　　膜蛋白酵母雙雜交主要原理是基于分離的泛素(split-ubiquitin)介導的DUAL membrane系統。該系統主要利用泛素(Ubiquitin,Ub)作為26S蛋白酶體降解蛋白標簽的特性，可分為N端(1-37個氨基酸NubI結構域，通常將第13位liangansuan突變為ganansuan或者binansuan(NubG)以降低與Cub的自重組)和C端(35-76個氨基酸Cub結構域)，當NubG和Cub相互靠近時，能夠發揮標簽功能，通過泛素修飾目標蛋白，使目標蛋白被泛素介導的蛋白酶體途徑識別并剪切。基于該原理，將Cub末端添加轉錄因子形成Cub-TF，在NubG與Cub-TF靠近后，可以將TF剪掉并進入細胞核，激活報道基因表達。
 

　　在進行膜體系酵母雙雜交實驗時，將誘餌蛋白X和獵物蛋白Y分別構建到Cub-TF載體和NubG載體，如果X和Y存在相互作用，則Cub-TF和NubG相互靠近，將TF進行泛素標記并被泛素特異性蛋白酶UBPs識別剪切后釋放并進入細胞核，激活報告基因表達。
 

圖 膜蛋白酵母雙雜交原理示意圖
 

　　技術優勢
 

　　基于報告基因表達產物累積效應，檢測靈敏度高；
 

　　以報告基因為檢測對象，可用于檢測弱蛋白相互作用或者瞬時相互作用；
 

　　無需抗體或者蛋白純化操作；
 

　　相對其他方法，成本較低；
 

　　技術缺陷
 

　　由于部分基因具有自激活效應，因此可能存在假陽性；
 

　　一定程度可以模擬生理互作，但與哺乳細胞仍有一定區別；
 

　　外源蛋白可能對酵母具有毒性，抑制酵母生長，干擾實驗結果；
 

　　Y2H技術流程
 

　　1、酵母感受態細胞制備
 

　　PS：經費充足的小伙伴可以直接購買商用感受態細胞，省時省力，經費稍顯緊張的小伙伴就只能按照以下步驟付出人力成本啦。
 

　　(1)取- 80℃保存的酵母菌株涂布到YPDA培養基平板，28℃倒置培養4-7 d；
 

　　(2)挑取單克隆菌落加入到10 mL YPDA液體培養基中，30℃，250 rpm條件下震蕩培養至OD600 = 1.4-1.8，并逐步擴大培養至50-100 mL；
 

　　(3)待菌株生長至合適密度時(OD600 = 0.6-0.8)，收集菌液，1000 g轉速下室溫離心5 min，收集細胞沉淀；
 

　　(5)加入50 mL無菌超純水(或者生理鹽水)重懸酵母細胞進行洗滌；
 

　　(6)1000 g轉速下室溫離心5 min，收集細胞沉淀；
 

　　(7)加入3 mL 1.1 × TE/LiAc重懸酵母細胞進行洗滌；
 

　　(8)重懸的酵母細胞等體積轉移至新的離心管，6000 g轉速下室溫離心30 s；
 

　　(9)收集沉淀并加入適量1.1 × TE/LiAc重懸酵母細胞，分裝至100 μL/管，-80℃保存備用。
 

　　2、酵母轉化
 

　　(1)取出酵母感受態細胞，分別加入10 μL ssDNA，0.1 μg質粒，PEG/LiAc 600 μL，渦旋混勻。(PS: ssDNA作用類似于鮭魚精DNA，避免質粒在轉入真核細胞中被降解。）
 

　　(2)30℃水浴30 min，加入70 μL DMSO；
 

　　(3)42℃熱激15 min，冰上冷卻2 min；
 

　　(4)2000 g轉速下室溫離心10 s，棄上清；
 

　　(5)加入1 mL無菌水(或者生理鹽水)重懸沉淀；
 

　　(6)吸取200 μL轉化混合物涂布到營養缺陷型培養平板中；
 

　　(7)28℃倒置培養2-4 d，觀察菌落生長情況。
 

圖 酵母雙雜交實驗流程示意圖(圖片來源于網絡)
 

　　由于酵母雙雜交系統可能存在自激活現象(與BD結構域結合的誘餌蛋白具有轉錄激活活性，在BD結合UAS序列后無需AD結構域即可激活下游報告基因表達；或者與BD結構域結合的誘餌蛋白與酵母內源具有轉錄激活活性的蛋白互作，激活下游報告基因表達)。為保證酵母雙雜交實驗結果的真實可靠性，在進行實驗時通常設置陰性對照組和陽性對照組、自激活組以及實驗組等(以核體系酵母雙雜交為例)。
 

　　陰性對照組：pGBKT7-Lam + pGADT7-ADT；
 

　　陽性對照組：pGBKT7-P53 + pGADT7-ADT；
 

　　自激活組：pGBKT7-X + pGADT7；
 

　　實驗組：pGBKT7-X + pGADT7-Y；
 

　　對照組(可選)：pGBKT7 + pGADT7；pGBKT7 + pGADT7-Y；
 

　　酵母雙雜交實驗時通常使用SD/ -Trp/ -Leu二缺培養板，用于驗證質粒轉化效果；SD/ -Trp/ -Leu/ -His三缺培養板，用于驗證是否存在自激活；SD/ -Trp/ -Leu/- His/ -Ade為四缺培養板，用于主要驗證互作結果。
 

酵母雙雜交結果示意圖(圖片參考網絡繪制)
 

　　如上圖所示，在二缺板中，所有分組均有菌落，說明質粒轉化成功。
 

　　pGBKT7-Lam + pGADT7-ADT組為陰性對照，由于Lam和ADT不存在互作，無法激活下游報告基因表達，因此在三缺板和四缺板中均未出現菌落；
 

　　pGBKT7-P53 + pGADT7-ADT組為陽性對照，由于P53與ADT存在互作，BD和AD靠近，激活下游報告基因表達，因此在三缺和四缺板中長出菌落；
 

　　pGBKT7-X + pGADT7為自激活組，若蛋白X沒有轉錄激活活性或者不存在具有轉錄激活活性的酵母內源蛋白與X互作，則三缺板和四缺板中無法長出菌落；若存在自激活現象，則在三缺板和四缺板中長出菌落；
 

　　pGBKT7-X + pGADT7-Y為實驗組，由于蛋白X和蛋白Y存在相互作用，因此能夠激活下游報告基因表達，可在三缺和四缺板中長出菌落。
 

　　PS：如果在培養板中加入X-gal，則在進行酵母雙雜交實驗時，陽性菌落因表達報告基因LacZ，將X-gal切割將成半乳糖和深藍色的底物5-溴-4氯靛藍，使得菌落呈現藍色；這也是為什么有些文章酵母雙雜交實驗菌落顏色為藍色。
 

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