食源性致病菌

食品安全問題是關乎人民生命健康和社會和諧的重大戰略問題，而食品致病菌是全球范圍內導致食品安全問題的主要因素。其中, 以、銅綠假單胞菌、單核增生李斯特菌、腸炎沙門氏菌、鮑曼不動桿菌等為代表的食源性致病菌嚴重威脅著消費者的健康, 由其引起的食源性疾病如腹痛、腹瀉以及嘔吐等癥狀近年來呈上升趨勢^[1]，世界衛生組織調查發現，在全球范圍內每年約有6億例食源性疾病發生，其中有42萬人因此死亡。因此，盡早的發現食源性致病菌是防止食源性疾病暴發的有效手段。

基于細胞培養的方法盡管一直以來被認為是食源性致病菌檢測的金標準，但該方法需要經過增菌、選擇性培養、純化、生化反應鑒定等步驟^[2]，存在過程繁瑣，且檢測耗時長等問題，難以滿足目前的快速檢測需求。而基于抗原抗體特異性結合反應原理的檢測方法雖然操作相對簡單，但靈敏性不足、容易造成漏檢。因此，開發新型快速高效的食源性致病菌檢測技術是亟待解決的重要問題。

常規免疫檢測及核酸檢測原理

CRISPR/Cas系統快速檢測原理

CRISPR/Cas系統由成簇、規則間隔的短回文重復序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）和關聯蛋白（CRISPR-associated protein，Cas）組成。CRISPR/Cas系統來源于細菌和古細菌的適應性免疫系統^[4]。近些年發現的Cas12和Cas13蛋白在CRISPR RNA (crRNA)或向導 RNA (single-guide RNA，sgRNA)引導下，除了具有識別并剪切特異靶標的順式剪切活性外，還具有可被靶標激活的反式剪切活性。即這些 Cas蛋白與crRNA在特異性識別靶標后，可被激活針對ssDNA或ssRNA的反式剪切活性。基于此原理，可將反式剪切底物設計成合適的報告探針(如熒光-淬滅基團修飾)，即可用于靶標核酸檢測。

CRISPR/Cas技術檢測食源性致病菌

致病菌的CRISPR/Cas核酸傳感器檢測可分為兩大類：①通過增菌后提取基因組，結合核酸擴增和Cas蛋白的剪切體系建立的核酸傳感器。②結合適配體實現致病菌向核酸的轉化，隨后直接或間接與CRISPR/Cas系統結合，建立相應的傳感器^[5]。在上文中，我們提到了5種常見的食源性致病菌，接下來，編者將以這5種食源性致病菌為例，展開論述現有的CRISPR/Cas檢測系統的原理及進展。

銅綠假單胞菌的雙重檢測

Gootenberg^[8]等基于重組酶聚合酶擴增技術 (Recombinase Polymerase Amplification, RPA)和CRISPR/Cas13建立了RPA-CRISPR/Cas-雙重熒光檢測系統。通過多重RPA擴增，再將擴增產物轉錄得到RNA靶標，兩種不同的RNA靶標分別與Cas13a/crRNA、Cas13b/crRNA結合并激活對應Cas13蛋白的反式剪切活性。根據Cas13蛋白反式剪切探針的偏好性，采取Cas13a剪切poly U探針，Cas13b剪切poly A探針，兩種探針分別標記不同的熒光基團，從而通過檢測兩種熒光信號強度的變化，實現對和銅綠假單胞菌的同時檢測。

RPA-CRISPR/Cas-雙重熒光檢測系統對黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的檢測

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