細(xì)胞：CAKI-2細(xì)胞
 

　　中文名稱：人腎癌細(xì)胞
 

　　生長(zhǎng)特性：貼壁細(xì)胞
 

　　CAKI-2細(xì)胞培養(yǎng)基：1640 培養(yǎng)基  血清：10%FBS(GIBCO胎牛血清)
 

　　凍存條件：50%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、40% FBS、10% DMSO
 

　　收到細(xì)胞后請(qǐng)盡快更換配套培養(yǎng)基，或自己配置的新鮮培養(yǎng)基(含15%血清)，如因特殊情況需要繼續(xù)使用原瓶培養(yǎng)基，請(qǐng)?jiān)谠颗囵B(yǎng)基中額外添加10%的血清(原瓶培養(yǎng)基的繼續(xù)使用時(shí)間最長(zhǎng)不宜超過(guò)72小時(shí))。
 

　　CAKI-2細(xì)胞傳代：
 

　　1)：細(xì)胞密度約80%時(shí)，吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，加2~3 ml 0.25% yi酶進(jìn)行消化細(xì)胞(注意根據(jù)實(shí)際情況，把握消化時(shí)間)。
 

　　2)：鏡下觀察消化情況，在細(xì)胞邊緣縮小，貼壁松動(dòng)時(shí)；
 

　　(可用吸管吸起些許yi酶輕輕吹打細(xì)胞層某處，即可肉眼可見(jiàn)細(xì)胞層脫落，或吹打后鏡下觀察吹打處，即消化完成，否則繼續(xù)消化)
 

　　直接吸掉yi酶，加3~4ml 培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞層，把細(xì)胞層吹落，吹散。
 

　　3)：取部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，把細(xì)胞懸液打勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
 

　　4)：注意培養(yǎng)基PH值變化情況，定期換液(每周2-3次)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%以后重復(fù)1項(xiàng)操作或者凍存。
 

　　(網(wǎng)絡(luò)信息主針對(duì)網(wǎng)絡(luò)推廣作用，僅供參考，細(xì)胞培養(yǎng)請(qǐng)咨詢細(xì)胞庫(kù)管理員，以細(xì)胞庫(kù)管理員提供給您的信息為準(zhǔn)，操作前，如果有不明白之處，先咨詢細(xì)胞庫(kù)管理員，避免不必要的損失；)
 

　　豬腦心肌炎病毒(EMCV)核酸擴(kuò)增檢測(cè)標(biāo)本(逆轉(zhuǎn)錄)
 

　　取出EMCV-RT MIX室溫溶解，向反應(yīng)管中每管加入7μl EMCV-RT MIX，1μl逆轉(zhuǎn)錄酶系(使用前請(qǐng)10,000rpm瞬時(shí)離心30s)， 以及2μl 上述獲得的RNA。1,0000rpm瞬時(shí)離心30秒，將各反應(yīng)管放入PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，在PCR儀上進(jìn)行以下循環(huán)：42℃ 30分鐘，后98℃5分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。
 

　　3.PCR擴(kuò)增
 

　　從試劑盒中取出EMCV-PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10,000rpm離心10s。
 

　　設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
 

　　(EMCV-PCR MIX 用量：24μl)(Taq酶系用量：2μl)
 

　　計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10,000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入26μl，向每管中加入處理后樣品(cDNA)或EMCV-陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品(使用前用陰性質(zhì)控品梯度稀釋10倍、100倍、1000倍，記為1×10P6PCopies/ml，1×10P5PCopies/ml，1×10P4PCopies/ml)和陰性質(zhì)控品4μl，10,000rpm瞬時(shí)離心30秒。將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品，陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品以及未知標(biāo)本，并設(shè)置反應(yīng)體積(30μl)、樣品名稱、標(biāo)記熒光基團(tuán)種類(報(bào)告基團(tuán)為FAM，淬滅基團(tuán)為T(mén)AMRA)和循環(huán)條件：
 

　　ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反應(yīng)蓋)，ABI PRISM7300/7500(使用8聯(lián)管)，MJ Opticon(使用8聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器，循環(huán)條件： 94℃→2分鐘，后93℃ 30秒→55℃ 45秒，40個(gè)循環(huán)。
 

　　LightCycler等使用毛細(xì)管的儀器，循環(huán)條件： 94℃→2分鐘，后93℃ 5秒→56℃ 45秒，共40個(gè)循環(huán)。