深圳子科生物報道：蛋白質優化工程能夠改良抗體、生物酶及其他蛋白質如基因編輯酶等，賦予新的特性或提升現有功能，實現臨床和研究應用的需要。修改氨基酸序列是蛋白質優化工程中的核心技術之一。近年，CRISPR-Cas基因編輯酶已成為醫學研究的重要工具。科學家正努力改良CRISPR-Cas酶，借修改其氨基酸序列，在多點位置換入其它氨基酸，以提高基因編輯的準確性和效率，以及提升修改致病基因治療的安全性和有效性。

香港大學李嘉誠醫學院（港大醫學院）生物醫學院的研究團隊成功開發一套全新技術，能夠大量組裝及有系統地引入多點修改到蛋白質變體中，并以條形碼編碼同時分析各個組合在篩選過程的頻率變化，在眾多組合中尋找出合適的組合修改。

這種新方法被稱為：CombiSEAL，相關研究成果公布在Nature Methods雜志上，由黃兆麟博士領導完成，目前已提交專li申請。

目前改良CRISPR-Cas酶以及其他蛋白質的挑戰，在于從眾多氨基酸序列組合變化中，篩選出合適的氨基酸替代組合。過多或過少的修改，可能對提高基因編輯酶的準確性和效率有負面影響。然而多個氨基酸變化的組合效應難以預測，并且隨著每個額外氨基酸的修改，蛋白質突變組合數量也大量增加。傳統定點誘變技術可逐一產生蛋白質變體，但不能建立具有多個變化的大型氨基酸變體文庫，進行大量的同時平行分析（massively-parallel analysis）。發展新的技術平臺，以大幅提高組裝和分析蛋白質變體的能力，有助于加速開發新一代基因組編輯酶。

在這篇文章中，研究人員開發了一種新技術能夠大量組裝，有系統地引入多點修改，這方法比傳統的逐一建構及檢測個別定點突變的變體，更為省時，且成本可大幅降低，而且更可以直接在人類細胞表達基因編輯酶及其他治療性蛋白質的活性。

研究團隊將其命名為“CombiSEAL”，利用這一技術，他們成功篩選出擁有更高基因編輯準確性的新Cas9基因編輯酶變體。新變體在不損失活性及靶點選擇范圍的同時，降低基因編輯錯誤的可能性。CombiSEAL技術平臺易于使用，可以用作高通量篩選并改良更多臨床應用的蛋白質，提升治療效果。

SpCas9 是CRISPR-Cas系統中被廣泛應用的基因編輯酶。研究團隊利用CombiSEAL技術，快速建造了948個SpCas9變體，這大型的蛋白質文庫中，每個變體包含1至8個氨基酸的替代修改。團隊將這文庫遞送到人類細胞中進行測試，有系統地量化每一個變體的基因編輯效率和準確性。

在這項研究中，SpCas9蛋白變體的數量大大*迄今已被報導的研究的變體總和。團隊成功篩選出可降低基因編輯錯誤的兩個新變體：Opti-SpCas9 和OptiHF-SpCas9，其中Opti-SpCas9擁有較高的基因編輯活性。

CombiSEAL的簡單一鍋式反應技術可制造大型變體文庫，并以短讀測序（short-read sequencing）帶有序列條碼的蛋白變體，分析每個組合的頻率變化，大幅提高篩選的通量。研究團隊未來可進一步擴大測試的規模，從而挑選出更的變體。

這項研究的重要性包括：
（1）港大醫學院團隊開發的CombiSEAL平臺，突破傳統技術，引入序列條碼標籤蛋白基因的變體，成功以高通量測序方法，快速分析多點氨基酸的變化組合，以瞭解變體組合與蛋白酶活性的關係。新的技術平臺可以廣泛應用于不同領域的實驗室，例如生物醫學、應用醫學，新藥及抗體開發和生物科技等，實現高通量表徵及篩選蛋白質變體。

黃兆麟博士表示：“這是一個大規模的構建與測試平臺，用于尋找*變體組合以優化蛋白質。一鍋式組裝技術和引入序列條碼，大大減少了建構變體庫及其功能表徵的時間和成本。”

(2）團隊篩選出新改良的基因組編輯酶變體Opti-SpCas9。黃兆麟博士指出：“Opti-SpCas9的準確性較高，對改善基因編輯術在臨床應用的安全性很有幫助，它同時擁有高編輯效率和保持了廣泛靶點范圍。”Opti-SpCas9與其他新改良的SpCas9變體不同，它是唯yi可用于U6啟動子下，可轉錄含有額外5'guanine的gRNAs，而不影響其效率的改良版 ；而這個特質有一個很重要的應用，因為要進行成千上萬sgRNA的大型基因組掃描（CRISPR-based genetic screen），必須要使用效率良好的U6啟動子，而Opti-SpCas9正具備進行大型掃描所需要條件，因此它將可以廣泛地被應用于高通量基因組篩選研究。

黃兆麟博士致力開發各種基于組合遺傳學的高通量篩選技術，用以剖析包括癌癥在內等疾病的致病機理，從而制定新的治療策略。早前的研究工作開發了用于分析基因相互作用的CombiGEM技術。研究成果已于2015年在Nature Methods和2016年在PNAS期刊上發表。此外，該團隊于2016年在期刊《遺傳學年度回顧》中發表了一篇評論文章，闡釋CombiGEM技術解決生物醫學研究的潛力和挑戰。而這項研究中開發了新的組合遺傳學技術CombiSEAL，更開拓了組合遺傳學于蛋白質優化工程的全新應用。

原文標題：

Combinatorial mutagenesis en masse optimizes the genome editing activities of SpCas9