RNA酶保護(hù)試驗(yàn)((RNase Protection Assay,RPA)是通過(guò)液相雜交的方式，用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測(cè)RNA表達(dá)的技術(shù)。與Northern雜交和RT-PCR比較，RPA有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

1. 檢測(cè)靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉(zhuǎn)膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進(jìn)行電泳，故損失小，提高了靈敏度。

2. 由于pcr擴(kuò)增過(guò)程中效率不均一和反應(yīng)“平臺(tái)”問(wèn)題，基于PCR產(chǎn)物量進(jìn)行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而RPA沒(méi)有擴(kuò)增過(guò)程，因此，分析的數(shù)據(jù)真實(shí)性較高。

3. 由于與反義rna探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進(jìn)行分析。

4. 步驟較少，耗時(shí)短。與Northern雜交相比，省去了轉(zhuǎn)膜和洗膜的過(guò)程。

5. RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高，無(wú)探針自身復(fù)性問(wèn)題，無(wú)須封閉。

6. 一個(gè)雜交體系中可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)探針雜交，無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性問(wèn)題。

7. 檢測(cè)分子長(zhǎng)度可以任意設(shè)置，靈活性大。

RPA的缺點(diǎn)是需要同位素標(biāo)記探針。

一、試劑準(zhǔn)備

1. GACU POOL：取100mM atp、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。

2. 雜交緩沖液：PIPES 0.134g、0.5M EDTA(pH8.0)20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。

3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA(pH8.0)20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml

二、操作步驟

1.反義RNA可由含T7或SP6啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒為模板制備，也可以用含啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物為模板制備，本文介紹后者。

① 設(shè)計(jì)含T7啟動(dòng)子的PCR引物

由于PCR產(chǎn)物將作為合成反義RNA的模板，所以一對(duì)引物中的下游引物5’-端要含T7啟動(dòng)子序列：

T7啟動(dòng)子序列為：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物設(shè)計(jì)的其他要求與一般PCR引物的設(shè)計(jì)相同。PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度決定了反義RNA探針的長(zhǎng)度，具體設(shè)計(jì)時(shí)可考慮100-400bp長(zhǎng)。采用巢式PCR，即先擴(kuò)增出一較長(zhǎng)的片段，再以該片段為模板擴(kuò)增出較短的片段，以保證探針的特異性。

② PCR

先用上游引物和下游引物Ⅰ進(jìn)行PCR，再以PCR 產(chǎn)物為模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進(jìn)行二次PCR(具體操作參見(jiàn)PCR章節(jié))。

③ 探針合成標(biāo)記與純化

在0.5ml 離心管中加入下列試劑：

RNasin (40U/μl) 0.5μl

GACU POOL GAC(含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM) 2μl

[α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μlDTT (二硫蘇糖醇，0.1M) 1μl

5×轉(zhuǎn)錄 buffer 2μl

模板(50ng/μl) 1μl

T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl

混合后，短暫離心，37℃保溫1hr。

加入DNaseⅠ(10U/μl)1μl，37℃ 15min，然后75℃10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

加入：飽和酚 50μl

氯防 50μl

酵母tRNA(2μg/μl) 4μl

DEPC H2O 100μl

室溫下充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100μl氯防，混勻，離心10000g×2min。將上層液轉(zhuǎn)移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10μl、預(yù)冷無(wú)水乙醇250μl，混勻后，-20℃靜置30min。4℃離心13500g×10min。棄上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗滌，4℃離心13500g×2min，棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。加入50μl雜交緩沖液溶解沉淀，4℃下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)探針質(zhì)量。(參見(jiàn)本節(jié)電泳步驟)。

2.雜交

① RNA提取后溶解在雜交緩沖液中，濃度為1μg/μl。

② 取8μl RNA加入1-3μl探針(根據(jù)探針檢測(cè)結(jié)果調(diào)整)于0.5ml 離心管中。

③ 80℃保溫2min，然后40-45℃下雜交12-18hr。

3. 消化

① 雜交管于37 ℃保溫15min，加入RNase消化液，37℃保溫30min。

② 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混勻，37℃保溫10min。

③ 加入65μl飽和酚和65μl氯防，混勻，室溫離心，10000g×2min。

④ 轉(zhuǎn)移上層液到另一0.5離心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl異丙醇，混勻后，置-20℃ 30min，4℃離心,135000g×10min。

⑤ 棄上清液，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，加入5-8μl上樣緩沖液溶解沉淀。

4、電泳與放射自顯影

① 配制凝膠：(50ml)

40%丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺(19：1) 6.25ml

5×TBE 10ml

尿素 24g

加H2O至50ml，溶解后加入25%過(guò)硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。

② 預(yù)電泳

以1×TBE為上下槽電泳緩沖液，加上電壓后進(jìn)行預(yù)電泳，如果用測(cè)序電泳裝置，電壓應(yīng)達(dá)2000v以上，功率設(shè)定為100w，溫度設(shè)為50℃。待膠板溫度達(dá)50℃時(shí)，暫停電泳，準(zhǔn)備加樣。

③ 加樣

將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80℃加熱2min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr。(電泳條件同預(yù)電泳)。

④ 電泳結(jié)束后，打開(kāi)膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒中，暗室紅光下，壓上一張X片，蓋上暗盒，-70℃曝光1-3天。暴光結(jié)束后，將X光片顯影、定影、水洗、晾干。

三、注意事項(xiàng)

1.本實(shí)驗(yàn)大部分為RNA操作，注意RNA酶的污染。

2.RNase消化液消化未雜交的單鏈RNA和探針RNA，當(dāng)探針與樣品之間有堿基錯(cuò)配時(shí)，錯(cuò)配位點(diǎn)也將被消化，因此會(huì)產(chǎn)生片段較小的雜交片段。因此進(jìn)行PCR時(shí)，采取盡量減少錯(cuò)配的措施。

3、 同位素對(duì)RNA合成有一定影響，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生非全長(zhǎng)的探針。因此，標(biāo)記時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

4、 RNase消化液有時(shí)會(huì)產(chǎn)生過(guò)度消化而無(wú)檢測(cè)信號(hào)，可以將消化液稀釋10-100倍后使用。

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