細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)替代胎牛血清的適應(yīng)
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許多細(xì)胞zui易于采用連續(xù)適用法。將含有FBS的通用培養(yǎng)基和含有替代胎牛血清的培養(yǎng)基按1：1(體積比)混合，用混合后的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。每次成功傳代后，按下列比例減少通用培養(yǎng)基的用量：
1：2、1：4、1：16、和99%含替代胎牛血清培養(yǎng)基。
對(duì)于每次胎牛血清的成分變化，都要將細(xì)胞傳代培養(yǎng)2-3次以進(jìn)行適應(yīng)，細(xì)胞可能可以適應(yīng)直接從FBS到替代胎牛血清的轉(zhuǎn)換。起初要使用和FBS濃度相同的替代胎牛血清。細(xì)胞生長(zhǎng)可能會(huì)發(fā)生延遲。可以傳代2-3次，使細(xì)胞生長(zhǎng)速率恢復(fù)到以前的水平。
細(xì)胞從單層生長(zhǎng)到懸浮培養(yǎng)適應(yīng) 貼壁細(xì)胞對(duì)懸浮培養(yǎng)的適應(yīng)可能需要提高細(xì)胞密度或使用無(wú)胎牛血清
培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞。本方案說(shuō)明了使用T-25或T-75培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞適應(yīng)時(shí)所需要的步驟。大約需要6-8個(gè)T-75培養(yǎng)瓶才可以提供一個(gè)轉(zhuǎn)瓶或搖瓶所需的Hela細(xì)胞量(5X107)。
注意：對(duì)于不同的細(xì)胞系，zui初培養(yǎng)瓶的細(xì)胞數(shù)量各不相同。為了得到*結(jié)果，請(qǐng)遵從下列事項(xiàng)：
使用50-80%匯合的細(xì)胞；
使用存活率大于90%的細(xì)胞。
1．去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
2．用不含鈣鎂的1XD-PBS沖洗細(xì)胞(T-25培養(yǎng)瓶中加3ml,T-75培養(yǎng)瓶中加5ml)。丟棄沖洗用的溶液。
3．將-EDTA(0.05%，0.53mMEDTA?4Na;T-25培養(yǎng)瓶
中加3ml，T-75培養(yǎng)瓶中加5ml)加到培養(yǎng)瓶中與細(xì)胞相對(duì)的一
側(cè)。搖動(dòng)培養(yǎng)瓶幾次。丟棄所有溶液，只保留能夠形成一薄層液
膜覆蓋住細(xì)胞的-EDTA即可。在37℃下孵育細(xì)胞5-10分
鐘。孵育期間用顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞都變圓后，輕敲培養(yǎng)瓶
以使細(xì)胞離開(kāi)瓶壁。
4．加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基(T-25培養(yǎng)瓶中加6ml,T-75培養(yǎng)瓶中加10ml) 使細(xì)胞懸浮。
注意：如果使用無(wú)胎牛血清培養(yǎng)基，應(yīng)加入大豆抑制劑。通常使0.25mg/ml的抑制劑，按1：1(體積比)的比例加入即可抑制。
5．將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一個(gè)15ml離心管中。用100Xg的速度離心4分鐘。吸去上清液(-EDTA與生長(zhǎng)培養(yǎng)基的混合物)。
6．用5ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。用100Xg的速度離心4分鐘。
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