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釀酒酵母感受態細胞的制備、轉化

時間:2012/12/17閱讀:1018
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釀酒酵母感受態細胞的制備
 
(1)從YPD平板上挑取一個新鮮的釀酒酵母EBY100單克隆至10 mlYPD液體培養基,30℃,250 rpm培養過夜;
(2)測定過夜培養物的OD600值為3.0~5.0之間;
(3)將10 ml YPD過夜培養物稀釋至OD600值為0.2~0.4;
(4)在28~30℃搖床中繼續培養3~6hr,使其OD600值達到0.6~1.0;
(5)于室溫1500g離心5 min收集酵母細胞,棄上清;
用10ml洗液洗酵母細胞,隨后于室溫1500g離心5 min離心收集細胞,棄上清;
(7)用1 ml TE/LiAc重懸酵母細胞,以每管50μl分裝。
 
釀酒酵母細胞的轉化
 
(1)取50μl感受態細胞,再加入待轉質粒各2μl,混勻;
(2)加入500μl 轉化用溶液(PEG/LiAc,二甲亞砜),彈擊管壁混勻;
(3)30℃水浴1hr,隔15min彈擊管壁混勻;
(4)加入1毫升YPD培養液,30℃搖床培養1小時
(5)3500g離心5 min ,留沉淀,棄上清;
沉淀用150μl TE重懸,涂相應的SD平板;將平板倒置于30℃培養。
 

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