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（1）純化法
在去除不需要的組織后，使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復清洗2~3次。將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的（100 mg組織加入1ml ）。在4℃孵育6~18h，使幾乎沒有活性的酶盡可能滲透進去。移棄組織碎片中在37℃孵育包含殘留的組織碎片20~30分鐘。在組織碎片加入熱的培養基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養基，要加入大豆抑制劑。
通過無菌不銹鋼絲網（100~200 mm）過濾，分散所有剩余組織，計數和接種細胞，進行培養。
（2）膠原酶純化法
用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用平衡液清洗組織碎片幾次。加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在平衡液中），在37℃孵育4~18小時。加入3mM CaCl2增加解離效率。通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。通過離心在平衡液中清洗懸液幾次。再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養。
（3）Dispase純化法
用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用不含鈣鎂的清洗組織碎片幾次。加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的）在37℃孵育20分鐘~幾個小時。通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。
通過離心在中清洗懸液幾次，再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養。
分離細胞后，首-次傳代需要注意的問題：
傳代培養時先觀察細胞的活性。細胞的活率應該超過90%，密度控制在80%左右。
對于無血清培養基，需要降低使用量。
1. 移棄使用過的細胞培養基。
2. 使用不包含有鈣鎂的或EDTA清洗細胞。在培養瓶背著細胞的一面加入清洗溶液，通過轉動培養瓶1~2分鐘清洗細胞層，然后去除清洗液。
3. 加入消化，消化細胞與細胞，操作手法，試劑的效價有密切的關系，消化時應注意觀察細胞形態，如細胞變得橢圓透亮，并且可以觀察到細胞與細胞間的間隙時，輕拍瓶身可以看見成流沙狀，即可中止消化，消化時盡量減少對細胞的吹打。
4. 當細胞分離時，垂直放置培養瓶，讓細胞流到培養瓶的底部。在培養瓶中加入培養基中止消化，計數并再次培養細胞。
5. 對于無血清培養基，加入大豆抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25 mg/ml抑制劑到中將抑制活性。
