聯系電話
上海勁馬實驗設備有限公司
中級會員·17年
- 聯系人：
- 馮經理
- 電話：
- 021-60521817
- 手機：
- 13817140470
- 售后：
- 86-021-61107441
- 傳真：
- 86－021－64881400
- 地址：
- 上海市松江區漕河涇研展路455號B座
- 個性化：
- www.shjmsw.com
- 手機站：
- m.shjmsw.com
- 網址：
- www.shjmsw.com
掃一掃訪問手機商鋪
簡介
蛋白質的抽提是指破碎過程中，將生物材料在水，緩沖液或稀鹽溶液等適當溶劑中浸泡，使胞內的蛋白質等內容物釋放到溶劑中。
與細胞總蛋白的提取實驗相似的是動物組織的總蛋白提取，它需要勻漿機或者研磨棒將組織塊分散，再加入裂解液并提取蛋白質。
原理
細胞蛋白的提取是生物學實驗中一種常見的實驗方法，是很多其他生物學實驗的前提。通過加入裂解緩沖溶液以及相應的蛋白酶抑制劑，能較好的保持細胞內生物大分子的天然狀態，在透膜劑以及超聲破碎儀的輔助下，細胞將發生破裂，內容物釋放出來。
用途
1. 蛋白免疫印跡；
2. 蛋白免疫沉淀；
3. 核漿分離等制備型和分析型實驗。
材料與儀器
細胞、細胞刮、裂解液、槍頭、燒杯、超聲破碎儀，離心機，EP 管，制冰機，記號筆。
步驟
一、蛋白提取
1. 從培養箱中取出待提取的細胞，用吸引器洗掉培養基后，將培養皿置于冰上；
2. 往培養皿中加入適量的裂解液，并加入相應量的蛋白酶抑制劑，一般來說，12 孔板加入100 μL 裂解液，6 cm 皿加入 300-400 μL 裂解液，晃動培養皿，使得裂解液流過細胞表面；
3. 在冰上用細胞刮將細胞刮離培養皿，并收集到 1.5 mL EP 管中；
4. 在冰上超聲破碎細胞（根據儀器的功率調節），一般超聲 10-15 下即可；
5. 超聲好的細胞放入離心機中，12000 g，4℃，離心 15 分鐘；
6. 離心完后，取出 EP，小心的將上清液轉移至一干凈的 EP 管中，待用。
二、蛋白濃度的測定
1. 取 96 孔板，5 孔，每孔加入 10 μL 0.9% NaCl，最后一孔加入 10 μL 2 mg/ml 的 BSA 溶液，在倒數第二孔加入 10 μL BSA，用移液槍吹打混勻之后，吸出 10 μL 至倒數第三孔中，同樣操作一直至第二孔混勻后，棄 10 μL 溶液，此為標準曲線孔；
2. 另取孔，每孔 8 μL 0.9% NaCl 溶液，再加入 2 μL 提好的蛋白溶液；
3. 按照蛋白濃度測定試劑盒的說明配制好測定液，在上述濃度測定孔中每孔加入 200 μL 混合液，將平板放入 37℃ 生化箱中孵育 15-20 分鐘，再用酶標儀測定，做出標準曲線并計算每個蛋白樣品的濃度；
4. 提取好的蛋白上清液加入等量的 2 x loading buffer，并在沸水中煮沸 15 分鐘；
5. 一般細胞樣品按照 30 μg 的總上樣量計算出相應的上樣體積，記錄備用，并用于后續實驗。
注意事項
1. 有些蛋白容易降解，所以樣品需要一直放在冰上，樣品用完后短期負二十冰箱保存；
2. 勤換槍頭，避免交叉污染；
3. 超聲的次數和功率不能劇烈，容易使得蛋白斷裂；
4. 檢測磷酸化蛋白，盡量添加磷酸酶抑制劑；
5. 由于某些蛋白的特性，樣品不需要煮沸。
常見問題
1. 蛋白拖尾？
可能是超聲太過劇烈，并且超聲太過劇烈，對于一些小體積的樣本，非常容易造成樣品飛濺，損失樣品。
2. 蛋白濃度太低？上樣量太大？
應按照個人經驗和不同細胞的特性，適當的調整裂解液加入的體積，并且在最后可以加入 5 x loading buffer 來變性樣品。
