人AAVS1位點的TALENs質粒活性驗證

摘要：利用T7E1 活性分析實驗驗證AAVS1位點的TALENs質粒對的活性。實驗表明，該質粒對可以識別CCCCTCCACCCCACAGT和TTTCTGTCACCAATCCT序列，切割效率約為10%。配合Donor質粒，可以地將外源基因定點插入到AAVS1位點。可用于篩選定點整合穩定細胞株。
關鍵詞：T7E1，AAVS1，TALENs， 定點整合穩定細胞株

一、 實驗原理
在293T細胞中共轉針對AAVS1位點的TALENs質粒， TALENs質粒會表達相應的蛋白如果具有切割活性將會在識別位點中間預測的位置造成DNA雙鏈斷裂，在細胞進行易錯修復后造成隨機的突變(一般會缺失部分堿基，某些情況下也會添加)。當利用引物切割位點上下游的引物進行PCR的時候，產物為兩類PCR產物的混合物：正常序列的PCR產物和突變序列的PCR產物。對PCR產物進行變性和退火以后，這兩類產物會隨機配對，會有一部分正常序列的PCR產物和突變序列的PCR產物組成雜合鏈。在使用可以特異識別不*配對區域的T7E1酶處理后，雜合鏈將會被切斷。利用DNA PAGE膠，相對于對照組會有預測大小的切割條帶出現。如果TALENs質粒沒有活性，則不會有切割條帶出現。

二、 實驗目的
驗證識別CCCCTCCACCCCACAGT和TTTCTGTCACCAATCCT序列的TALENs切割質粒對在293T細胞中的切割活性。

三、 實驗步驟
1. 引物設計合成：
AAVS1-F1-311 : CCTGTCATGGCATCTTCC
AAVS1-R1-311 : TAAGGAATCTGCCTAAC
位于TALENs識別位點上下游，可獲得311bp長PCR產物，用于T7E1實驗。
2. TALENs細胞樣品的準備：
293T細胞70%匯合度時按照轉染試劑說明書，共轉AAVS1 TALENs質粒， 同時轉染TALENs空質粒作為對照， 轉染3天后， 收集樣品， 抽提基因組DNA。
3. PCR：將基因組DNA作為模板，使用AAVS1-R1-311和AAVS1-F1-311引物進行PCR，得到311bp產物。

                                                                   PCR反應體系

                                                           PCR循環條件
                                           

                                                           1    2    3

1． Con
2． TALENs treated
3． DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp

4. T7E1活性分析實驗-退火：
取以上PCR產物(311bp)各10μl， 放入PCR按照以下程序進行退火： 95℃ 5 min， 以-2度/秒的速度降至85度，再以-0.1度/秒降至25度， 4℃保存。
5. T7E1活性分析實驗-酶切：
每個樣品加入1μl T7E1酶，37℃酶切40min。
6. T7E1活性分析實驗-DNA PAGE電泳，染色：
酶切好的樣品加入5X Orange G 上樣緩沖液，在12%的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，使用1XTBE作為電泳緩沖液，恒壓80V電泳15min后150V電泳至 Orange G染料至底部。凝膠取下后，在50ml 1XTBE 中加入10μl gold view 染料，搖床震蕩10min后，用去離子水洗三次。紫外凝膠成像儀觀察，拍照。

                                   
                                             圖1. T7E1切割活性檢測PAGE膠電泳圖

四、 實驗結果
T7E1活性分析實驗結論：
TALENs轉染組的T7E1酶切后可見兩條預測大小的切割條帶（~208bp，~103bp），在對照組同樣位置沒有發現同樣大小的條帶。結果證實pTALEN-AAVS1-F和pTALEN-AAVS1-R質粒對在293T細胞中具有切割活性。經過灰度分析，切割效率約為10%。

五、 參考文獻
1. Ramakrishna S, Kim YH, Kim H.Stability of zinc finger nuclease protein is enhanced by the proteasome inhibitor MG132. PLoS One. 2013;1:e54282