Oct-4過表達慢病毒包裝純化實驗

摘要：本實驗使用四質粒包裝系統獲得高滴度的過表達human Oct-4基因的慢病毒顆粒。病毒滴度的檢測使用qPCR定量檢測慢病毒在細胞基因組中的整合拷貝數，能夠嚴謹客觀地反應慢病毒的感染和整合能力。該慢病毒系統中外源基因的表達框為pLenti–CMV- Oct-4-EGFP-3FLAG-PGK-Puro：CMV啟動子驅動Oct-4-EGFP基因的表達， 同時由PGK啟動子驅動puromycin抗性基因的表達。其中EGFP可以用于觀察慢病毒的工作狀況，Puromycin抗性基因可以用于快速篩選穩定細胞株。
關鍵詞：四質粒慢病毒包裝系統，Oct-4-EGFP，高滴度慢病毒包裝，慢病毒純化，qPCR

一、 實驗原理
慢病毒(Lentivirus) 載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷Ⅰ型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。
慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果。對于一些較難轉染的細胞， 如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因或目的shRNA的轉導效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，能夠比較方便快捷地實現目的基因或目的shRNA的長期、穩定表達。
所以，在體外實驗及體內實驗的研究中，慢病毒己經成為表達外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一， 并且正在獲得越來越廣泛的應用。

二、 實驗目的
使用四質粒包裝系統獲得高滴度的過表達human Oct-4基因的慢病毒顆粒，用于研究Oct-4基因功能學研究。

三、 實驗步驟
1. 載體選擇及構建（構建方法詳見第4頁）：
                                           

                                                                                              pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro圖譜：

2. 病毒包裝：
包裝細胞準備：
1) 細胞復蘇：
a) 準備適當的滅菌培養瓶，標上細胞系名稱、傳代數和日期。
b) 液氮罐中取出凍存的細胞，并在密封容器中轉移到實驗室中。
c) 將細胞從容器中拿出到適當溫度中的水浴箱中，用37℃水浴。只浸沒凍存管的下半部分，解凍到凍存管中只剩少量固體，通常需要  
1-2min，迅速轉移到生物安全柜中。
d) 用70%酒精棉擦拭凍存管的外部，并無菌打開凍存管。
e) 慢慢的用移液管逐滴移至37℃溫育過的培養液中，用以稀釋凍存液中的DMSO。
f) 在37℃，5%CO2中進行培養。
g) 24h后倒置顯微鏡觀察細胞狀態，如果有必要需進行傳代。
2) 細胞傳代：
a) 倒置顯微鏡觀察細胞，評估細胞匯合的程度以及確認無細菌和真菌污染。
b) 移去培養瓶中的培養液。
c) 相當于培養液體積一半的PBS清洗單層細胞，一般三次即可。
d) 按1ml/25cm2表面積的量加入0.25%*消化單層細胞。搖晃培養瓶使其*覆蓋細胞單層，倒出多余的*。
e) 將培養瓶放回培養箱，放置2-10min。
f) 用倒置顯微鏡觀察細胞以確保所有細胞都分離且漂浮，輕拍培養瓶的一側來釋放殘留的貼壁細胞。
g) 用少量的含新鮮血清的培養液重懸細胞以滅活*，取出100-200μl用于計數。
h) 將所需數量的細胞移至一個新標記好的含溫育過培養液的培養瓶中或者培養板上；選擇適當培養條件培養細胞系。
i) 按照細胞系的生長特性重復該步驟，直到細胞狀態良好、無污染，可以鋪板使用，其余選擇凍存。
3) 活細胞計數：
a) 取一瓶傳代的細胞，待長成單層以后使用；細胞懸液的制備方法：用0.25%的*消化、PBS液洗滌后，加入培養液（或Hanks液或PBS等*），吹打制成待測細胞懸液。
b) 蓋好蓋玻片，取一套血球計數槽，制備計數用的細胞懸液：用吸管吸適量細胞懸液到離心管中，加入等體積臺盼藍染液，加入染液后就可以在顯微鏡下區別活細胞和死細胞。若僅是單純的進行細胞計數，不考慮細胞的活力，則可不使用臺盼藍染色。
c) 將細胞懸液滴入計數板，注意蓋玻片下不要有氣泡，也不要懸液流入旁邊槽中。
d) 統計四個大格的細胞數，將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數板，當看到鏡中出現計數方格后，數出四角的大格（每格含有16個中格）中沒有被染液染上色的細胞數目。
e) 計算原細胞懸液的細胞數。按照下面公式計算細胞密度：
（細胞懸液的細胞數）/ml=（四個大格子細胞數/4）×2×104
說明：公式中除以4因為計數了4個大格的細胞數。
公式中乘以2因為細胞懸液于染液1：1稀釋。
1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）=0.1mm3；1ml=1000mm3
4) 細胞凍存：
用倒置顯微鏡觀察細胞，評估細胞密度以及確認無細菌和真菌污染，移去培養瓶中的培養液，用相當于培養液體積一半的PBS清洗單層細胞，一般三次即可，按1ml/25cm2表面積的量加入0.25%*消化單層細胞。搖晃培養瓶使*覆蓋細胞單層。倒出多余的*，將培養瓶放回培養箱，放置2~10min，用倒置顯微鏡觀察細胞以確保所有細胞都分離且漂浮，輕拍培養瓶的一側來釋放殘留的貼壁細胞，用少量的含新鮮血清的培養液重懸細胞以滅活*。取出100~200μl用于計數。為了凍存后有好的復蘇效果，理想細胞的存活率應超過90%。將剩余的細胞150g離心5min，在凍存培養液中，以2~4×106個細胞/ml的密度重懸細胞，吸取1ml細胞懸液轉移至標有細胞系名稱、傳代次數的凍存管中，將凍存管放置凍存盒中放入-80℃冰箱過夜，zui后將冷凍的凍存管轉移到液氮的氣相層內存放，并記錄位置。

包裝過程：
1) 轉染前一天，將細胞接種到100mm dish中，控制細胞轉染時的密度為70-80%。
2) 轉染前一小時取出細胞培養板，去除原有細胞培養基，加入10ml的Opti-MEM培養基，將細胞放回培養箱。
3) 制備轉染試劑和質粒的復合物： 
? 將待轉染的病毒載體質粒32μg（骨架質粒：穿梭質粒=1:1）溶于Opti-MEM培養基，總體積為500μl，輕輕混勻，靜置5min。 
? 將Obio轉染試劑溶于Opti-MEM培養基，總體積為500μl，輕輕混勻，靜置5min。 
? 將Obio轉染試劑稀釋液滴加到質粒稀釋液中，邊加邊輕輕混勻后在室溫放置20min，使DNA和Obio轉染試劑充分結合形成穩定的轉染復合體。
? 取出細胞培養板，將上面配好的DNA- Obio轉染試劑復合體加入到細胞培養板中，做好標記，放回培養箱。
? 6h后吸去培養基，PBS洗一次，加入10ml新鮮*培養基培養。
關于病毒轉染試劑及轉染信息，請登陸：http://www.oobio.com.cn/。
包裝熒光拍照質控結果：

收毒：
1) 轉染48h后，*次收毒，收集培養基至50ml離心管中，做上標記，并給細胞更換新鮮的*培養基。
2) 轉染72h后，第二次收毒，收集培養基至50ml離心管中，做上標記，丟棄細胞。
注：廢棄的含病毒的培養基加入84消毒液（1:20左右），浸泡一天后丟棄。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養板等其他物品可用84消毒液稀釋液處理，也可以用煮沸處理半小時或高壓濕熱滅菌（121℃，30min）處理。

3. 慢病毒純化：
1) 普通離心機：3500rpm，10min，RT離心后，上清馬上倒入新的50ml離心管，0.45μm，過濾上清到超速離心管中。上清分裝到12支超速離心管，兩兩對應配平衡，不夠的體積可用不含血清的培養基配平。
2) 超速離心機：HITACHI，30,000rpm，2h，4℃，離心后，可觀察到管壁一側有白色的病毒沉淀，做上記號。在安全柜中，打開離心管，小心地棄上清，離心管倒扣在滅菌過的吸水紙上，棄未去除干凈的上清。每管根據沉淀量添加DPBS，80μl-120μl/管，用封口膜封住管口，4℃溶解沉淀過夜。
3) 將同一種病毒，逐管收集法收集病毒到zui后一管，再用100μl DPBS收集2次，全部收到1.5ml 離心管中，按要求分裝病毒，標記（病毒名稱，年-月-日）-80℃冰箱保存。

4. 慢病毒滴度檢測（Real time 定量PCR 法測定滴度）：
1) 樣品制備：
a) 消化293T細胞，按1×105細胞每孔接種24孔板。
b) 細胞貼壁后（鋪板后4~6h）加入病毒。
c) 12~20h后換液，去掉含病毒的培養基。
d) 感染后72h拍照記錄熒光，收集細胞抽取基因組DNA并做定量PCR實驗測定滴度。
2) Real-time PCR 檢測：
Real-time PCR 在ABI7500 上完成。SYBR Master Mixture 來自TAKARA。
a) 下列比例配置反應體系：
                                                        

b) 設定程序為兩步法Real-Time 定量。預變性95℃，15s，之后每一步變性95℃，5s，退火延伸60℃，34s，共進行40 個循環。每次在延伸階段讀取吸光值。
Cycle 1: (1X)
Step 1: 95.0 ℃ for 00:15.
Cycle 2: (40X)
Step 1: 95.0 ℃ for 00:05.
Step 2: 60.0 ℃ for 00:34.
Data collection and real-time analysis enabled.
c) 制作熔解曲線。PCR 結束后， 在95℃變性1min。然后冷卻至55℃，使DNA 雙鏈充分結合。從55℃開始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30s， 同時讀取吸光值。
Cycle 3: (1X)
Step 1: 95.0 ℃ for 01:00.
Cycle 4: (1X)
Step 1: 55.0 ℃ for 01:00.
Cycle 5: (81X)
Step 1: 55.0 ℃-95.0 ℃ for 00:30.
Increase set point temperature after cycle 2 by 0.5 ℃

3) 滴度報告：
                                                

5. 慢病毒表達檢測：
慢病毒感染工具細胞-293T，WB檢測病毒表達情況（24孔板為例）：
*天：細胞準備：
將長勢良好的293T細胞接種到24孔板，消化好細胞后把細胞濃度調為1×105個/ml，按500μl/孔加入。接種細胞數量因細胞的生長速度而略有不同，一般是保證第二天進行病毒感染時細胞匯合率介于30-50%之間。
第二天：病毒感染：
感染實驗分兩組，按MOI 10、20加入病毒數 。加入感染增強劑，終濃度為5μg/ml。
第三天：換液：
感染8-12h后，棄去上清，換新鮮的*培養基，500μl/孔。
(注：某些特殊細胞可以更換一半病毒液后，過夜，具體請咨詢公司信箱：techservice@oobio.com.cn
第五天：觀察熒光表達情況，收集蛋白樣品，進行WB實驗。
四、 參考文獻
1. Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel RJ, Nguyen M, Trono D, Naldini L.A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.J Virol. 1998 Nov;72(11):8463-71.
2. Naldini L, Blömer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma IM, Trono D.In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.Science. 1996 Apr 12;272(5259):263-7.
3. Zennou V, Petit C, Guetard D, Nerhbass U, Montagnier L, Charneau P.HIV-1 genome nuclear import is mediated by a central DNA flap.Cell. 2000 Apr 14;101(2):173-85.
4. Zufferey R, Dull T, Mandel RJ, Bukovsky A, Quiroz D, Naldini L, Trono D.Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.J Virol. 1998 Dec;72(12):9873-80.
5. Zufferey R, Donello JE, Trono D, Hope TJ.Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors.J Virol. 1999 Apr;73(4):2886-92.