摘要：設計針對human Oct-4的shRNA干擾片段。通過分子生物學手段將該干擾片段構建入慢病毒載體（pLenti-U6-shRNA-CMV- EGFP-T2A-Puro）的U6啟動子下游，該載體可以實現在干擾Oct-4基因的同時表達綠色熒光蛋白EGFP和puromycin抗性基因，前者便于觀察載體工作狀態，后者方便篩選Oct-4干擾的穩定細胞株。除了可以直接瞬時轉染細胞用于Oct-4基因的干擾，該載體更可以包裝慢病毒，用于穩定株的篩選以及在動物水平干擾Oct-4基因的表達。
關鍵詞：Oct-4，RNAi， shRNA， EGFP， puromycin， lentivirus vector

一、 實驗原理
RNA干擾（RNA interference， RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發的、同源mRNA特異性降解的現象。由于使用RNAi技術可以特異性降低或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。shRNA作為RNA干擾的一種方法，是利用人源和鼠源的U6和H1等RNA聚合酶Ⅲ（pol Ⅲ）啟動子轉錄短的干擾RNA (siRNA， 19-21個核苷酸的RNA 雙鏈)的DNA分子。細胞內轉錄的shRNA被加工后摻入RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex， RISC），引導核酸酶降解靶RNA。
shRNA表達載體的優點在于可以進行較長期研究——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數星期甚至更久。病毒載體也可用于siRNA表達，其優勢在于可以直接率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質粒轉染效率低而帶來的種種不便，而且轉染效果更加穩定。
所選用的干擾載體pLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-Puro載體圖譜如下。用Age I和EcoR I酶切切去U6啟動子下游的ccdB毒性基因，插入待構建的shRNA序列。

 
二、 實驗目的
構建帶有EGFP熒光標記和puromycin抗性基因標記的human Oct-4干擾慢病毒載體。

三、 實驗步驟
根據human Oct-4基因的轉錄本設計3到4個siRNA靶點，安排引物合成。將單鏈的引物退火成雙鏈oligo序列，連接入雙酶切線性化的RNA干擾載體，替換掉原來的ccdB毒性基因。菌落PCR篩選轉化子，篩選的的陽性克隆進行測序驗證。測序驗證正確的克隆，進行高純度質粒抽提。實驗共分以下8個主要步驟：
1. 干擾靶點設計和引物合成：
根據shRNA設計的一般原則以及和元生物的豐富經驗，設計3到4個siRNA靶點，安排引物合成。
2. 引物退火形成帶粘性末端的雙鏈片段：
將合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互補單鏈各取30μl混合。然后將oligo混合物在水浴鍋中95℃加熱5min，然后水浴鍋開蓋置室溫中自然冷卻至室溫，形成雙鏈oligo片段。取1μl用于后續的連接反應，其余-20℃保存。
3. 線性化表達載體的制備：
用限制性內切酶對表達載體進行酶切，酶切反應體系為：質粒2μg，10 x反應Buffer 5μl，限制性內切酶各1μl，去離子水補足50μl，于37℃水浴鍋中孵育2h以上。酶切產物進行進行瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，并把目的載體條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收，具體步驟參考試劑盒說明書。
4. 干擾片段連接入表達載體：

                                                                連接反應體系
      

         于16℃ 連接過夜。

說明：陽性對照所加的退火的雙鏈oligo是以前退火好的驗證好用的片段，和連接組所加的退火的雙鏈oligo長度一樣，但序列無關。
5. 感受態細胞的轉化：
DH5α感受態細胞的轉化，詳見《精編分子生物學實驗指南》。
6. 菌落PCR鑒定陽性轉化子：
挑取平板上長出的轉化子重懸于10µl LB培養液中，取1µl做模板進行菌落PCR鑒定。反應體系和PCR循環條件如下：

7. 陽性克隆送測序：
菌落鑒定得到的陽性克隆，送測序公司進行測序驗證。用Vector NTI軟件比對測序結果，對測序結果進行分析。
8. 質粒小提：
經測序驗證正確的陽性克隆，安排質粒小提。具體步驟見試劑盒說明書。

四、 實驗結果
1. siRNA 序列和引物合成：
                                                                 siRNA 序列

病毒載體構建框架

DNA引物片段：
pY1001-1  CCGGAGAAAGAACTCGAGCAATTCTCAAGAGAAATTGCTCGAGTTCTTTCTTTTTTTG
pY1001-2  AATTCAAAAAAAGAAAGAACTCGAGCAATTTCTCTTGAGAATTGCTCGAGTTCTTTCT　
pY1002-1  CCGGCCGTGAAGCTGGAGAAGGATTCAAGAGATCCTTCTCCAGCTTCACGGTTTTTTG
pY1002-2  AATTCAAAAAACCGTGAAGCTGGAGAAGGATCTCTTGAATCCTTCTCCAGCTTCACGG　
pY1003-1  CCGGGCTTCAAGAACATGTGTAATTCAAGAGATTACACATGTTCTTGAAGCTTTTTTG
pY1003-2  AATTCAAAAAAGCTTCAAGAACATGTGTAATCTCTTGAATTACACATGTTCTTGAAGC　
pY1004-1  CCGGGGGAGGAGCTAGGGAAAGATTCAAGAGATCTTTCCCTAGCTCCTCCCTTTTTTG
pY1004-2  AATTCAAAAAAGGGAGGAGCTAGGGAAAGATCTCTTGAATCTTTCCCTAGCTCCTCCC　
pYNC-GP-1  CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG
pYNC-GP-2  AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA

2. 表達載體的線性化：
用Age I和EcoR I對表達載體進行雙酶切，膠回收8.2kb的載體片段，酶切圖譜如下： 
               1    2    3

          
1. 空質粒
2. 1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
3. 經Age I和EcoR I雙酶切的pLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-Puro載體

3. 菌落PCR鑒定陽性克隆：
用菌落PCR鑒定轉化子，正向引物hU6-F2：TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG 位于人U6啟動子序列中，反向引物pY-SEQR：  CTATTAATAACTAATGCATGGC位于CMV啟動子的5’序列，陽性克隆得到331bp的片段，陰性對照得到586bp的片段。
pY1001菌落PCR鑒定圖：

      1    2     3      4      5     6      7      8     9     10    11

1. 陰性對照（空載體）
2. 陽性對照（pYNC-GP質粒）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.  挑取的8個轉化子

pY1002菌落PCR鑒定圖：
    1    2      3      4      5     6       7     8     9      10   11

 
1. 陰性對照（空載體）
2. 陽性對照（pYNC-GP質粒）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.  挑取的8個轉化子

pY1003菌落PCR鑒定圖：

     1      2      3      4      5     6       7     8      9     10    11

 
1. 陰性對照（空載體）
2. 陽性對照（pYNC-GP質粒）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.  挑取的8個轉化子

pY1004菌落PCR鑒定圖：

      1    2      3      4      5     6      7      8      9    10    11

1. 陰性對照（空載體）
2. 陽性對照（pYNC-GP質粒）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.  挑取的8個轉化子

4. 測序結果分析：
pY1001測序結果：
CCCCCCCATATCCAGCCTGTTGAGAGAATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAGAAAGAACTCGAGCAATTCTCAAGAGAAATTGCTCGAGTTCTTTCTTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCATGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGTCGAGCTGGACGCGACGTAACGCACAGTTCAGCGTGTCGGCGAGGGCGAGGCGATGCCACCTACCGCAGCTGACCTGAAGTCATCTGACACGCAGCTGCTGACTTGACCACCTTTGACACCTGACTACGCGTGATGTCAGCGTAACCGACCATGAGACGACTCTCTAGTCCATGCCAGACTTCTAGAGGACAATTCTTCGAAGATAGAAGCGG

pY1002測序結果（由于發夾結構，2個陽性克隆均測序中斷）：
pY1003測序結果：
CAACCGGGCTTGGTTAGAGAGACATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAcAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGCTTCAAGAACATGTGTAATTCAAGAGATTACACATGTTCTTGAAGCTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACGGGACGCCACCATGTGAGCAGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCTGTCGAGCTGACGCGACGTAACGCACAGTCAGCGTGTCGGCAGGCGAGGCGATGCACTACGCAGCTGACCTGAGTCATCTGCACACGCAGCTGCGTGCCTGTACTCGTGACCACCTGACCTACGCTGCATGCTCAGCGCTACCCGACCATGAAGCACCGACTCTCAGTCGCATGCCGAAGGCTCGTCCGGAGGCCAACTTCCAGGCACGGCATTCAGATCCCACCAGGTGAAGTTCCAGGGG

pY1004測序結果（由于發夾結構，2個陽性克隆均測序中斷）：
pYNC-GP測序結果：
CTTTAATATACTTTGACTGTAAAAACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGT

TTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGGACGCCACCATGATGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACTTACGGGCAGCTGAACCCTTGAAAGTTCATCTGGCCCACCGGCAAGCTTGCCGTGACCTTGACCAGCCATCGTAACCACCCTGACCTACGCGTGCATGCTTCGGCGCTAACCCGGACATGAGCAGCACGGACTTCTTCAAGTTCGGCATGGCCGAGCTACGTCAGAGCGACATCTCTTCAAGACGACGCACTACAGATCCGACGCAGAGTGTAAATCA

五、 參考文獻
1. F.M.奧斯伯等著，馬學軍等譯，精編分子生物學實驗指南（第四版），科學出版社