引物設計基本原則

【資料簡介】

引物設計原則：

1。長度 一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，即taq酶的zui適溫度

2。堿基分布的均衡性 同一堿基連續出現不應超過5個

GC含量一般40-60%

GC含量太低導致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性

GC含量太高也易于引發非特異擴增。

3。引物Tm值 一般要求：55℃-65℃。

計算：

對于低于20個堿基的引物，Tm值可根據Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算

對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學參數，從“zui近鄰位”的計算方式得到，這也是現有的引物設計軟件zui常用的計算方式。

Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15

4。引物二級結構 引物二聚體

盡可能避免兩個引物分子之間3’端有有較多堿基互補發夾結構尤其是要避免引物3’端形成發夾結構，否則將嚴重影響dna聚合酶的延伸。

5。引物3’端 引物的延伸從3’端開始，因此3’端的幾個堿基與模板DNA均需嚴格配對，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸，甚至導致PCR擴增*失敗。考慮到密碼子的簡并性，引物3’端zui后一個堿基不與密碼子第三個堿基配對。

6。引物5’端 引物5’端可以有與模板DNA不配對堿基，在5’端引入一段非模板依賴性序列。

5’端加上限制性核酸內切酶位點序列(酶切位點5’端加上適當數量的保護堿基)。

5’端的某一位點修改某個堿基，人為地在產物中引入該位點的點突變以作研究。

5’端標記放射性元素或非放射性物質(如、)。

6。引物的內部穩定性 過去認為，引物3’端應牢牢結合在模板上才能有效地進行延伸，故3’端為G或C。

現在的觀點認為，引物的5’端應是相對穩定結構，而3’端在堿基配對的情況下為低穩定性結構，即3’端盡可能選用A或T，少用G或C。僅僅3’端幾個堿基與非特異位點上的堿基形成的低穩定性結構是難以有效引發引物延伸的，如果3’端為富含G、C的結構，只需3’端幾個堿基與模板互補結合，就可能引發延伸，造成假引發。

7。引物的保守性與特異性 保守性：通用引物——檢測同一類病原微生物盡可能多的型別

特異性：避免非特異性擴增