酵母剪接體實(shí)驗(yàn)操作方法

【資料簡(jiǎn)介】

1. 制備剪接體分析用競(jìng)爭(zhēng)性 RNA
 
(1) 戴無(wú)塵手套以避免手上 RNase 的污染。
 
(2) 從 8~16 只小鼠取出小腸和肝臟。一次處死一只小鼠并取出它的小腸和肝臟。 操作時(shí)要避免取到膽囊和胰腺，因?yàn)檫@些器官富含核酸酶。取出的小腸和肝臟應(yīng)立即置于液氮中，在 -70℃ 可保存過(guò)夜，在液氮中zui多可以保存 1 年。
 
(3) 準(zhǔn)備勻漿。室溫下在一塊干凈的紙巾上解凍幾塊小腸。盡可能擠出小腸中的殘留物，把小*成 5.08~7.62 cm 的小段，將其轉(zhuǎn)移至加有 10 ml 冰冷勻漿緩沖液的 50 ml 無(wú)菌的一次性聚丙烯離心管中。每只小鼠的器宮用 10 ml 勻漿緩沖液，如果緩沖液太少 RNA 的產(chǎn)量就會(huì)很低。肝臟可直接加到緩沖液中。
 
(4) 勻漿前，用 DEPC 處理水和乙醇洗滌勻漿頭。一次可勻漿 20~30 ml 的樣品，以中速對(duì)肝臟樣品勻漿 1 min，小腸勻漿 30 s。勻漿時(shí)間要求并不嚴(yán)格，主要依勻漿的情況而定。勻漿液應(yīng)該很稠，沒(méi)有明顯可見(jiàn)的組織塊。結(jié)束后，勻漿液放在室溫。
 
(5) 離心去掉殘?jiān)驖{液轉(zhuǎn)移到離心管中，于室溫、8500 g 離心 15 min 去掉殘?jiān)?br /> 
(6) 沉淀 RNA。把勻漿液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，避免吸到上清液上層的 1~2 ml 黏稠物和底部的殘?jiān)驖{液放在冰上于冷室中過(guò)夜（至少 6 h，zui多 2~3 天）。用高速離心機(jī)于 4℃、11000 g 離心 15 min 以離下 RNA 沉淀。
 
(7) 溶解 RNA 并用有機(jī)溶劑抽提。用 2.5 ml 溶解緩沖液溶解 RNA 沉淀，并轉(zhuǎn)移到一 corex 離心管中。戴上手套和防護(hù)鏡，穿上*，加等體積*到溶解的 RNA 中。渦旋混合水相和*溶液，再用高速離心機(jī)于 4℃、11000 g 離心 10 min 分離水相和黃色的*層，把含 RNA 的水相轉(zhuǎn)移到干凈的 Corex 管中。加 1 ml 新鮮的溶解緩沖液到*層中，重新抽提，合并水相。用等體積新的*重新抽提合并的水相。加 1~2 倍體積的：異戊醇到抽提出的水相中，渦旋混合，離心分離水相和有機(jī)相。把上層的水相轉(zhuǎn)移到干凈的 Corex 管中。
 
(8) 用醋酸鈉和乙醇沉淀 RNA，加入 1/15 體積的 3 mol/L 醋酸鈉（pH 5.4) 到水相中，然后加入 3 倍體積的無(wú)水乙醇，混合，干冰上放置 10 min 或 -20℃ 過(guò)夜。高速離心機(jī)上于 4°C 11000 g 離心，棄上清。室溫下用 70% 的乙醇洗兩次，吸出 70% 乙醇后，用干凈的紙巾吸出剩余的乙醇。
 
(9) 溶解并重新沉淀 RNA。用冷水溶解 RNA，每個(gè)器官 0.25 ml，置于冰上。對(duì)于 16 只小鼠，每種器宮應(yīng)有 3~4 ml 的 RNA 溶液。加 7.5 mol/L 醋酸銨到 RNA 溶液中，使其終濃度為 0.2 mol/L，混合后分成 400 μl 每個(gè)離心管。加 1.2 ml 無(wú)水乙醇到每管中，于 -70℃ 保存。
 
 (10) 制備競(jìng)爭(zhēng)性 RNA，在 4℃ 離心 2 或 3 管沉淀的 RNA（14000~15000 g，10 min)。室溫用 70% 乙醇洗兩次，并用旋轉(zhuǎn)真空濃縮儀干燥沉淀。用小體積的水溶解 RNA 并合并 RNA，總體積約為 100~150 μl。測(cè)出 RNA 的濃度和純度（取出少量，稀釋 500 或 1000 倍，測(cè)出 λ260 和 λ280 處的光吸收值，λ260 1OD 相當(dāng)于 40 μg/ml RNA)。競(jìng)爭(zhēng)性 RNA 的母液濃度應(yīng)為 20~30 μg/μl。OD260/OD280 高于或等于 1.6 時(shí)，RNA 可用于分析實(shí)驗(yàn)。這種溶解的 RNA 于 -70℃ 可保存兩年。
 
2. 灌制非變性凝膠
 
(1) 清洗玻璃板、梳子、墊片和硅烷化處理帶凹口的玻璃板，不要硅烷化另一塊玻璃板，否則電泳后分開(kāi)玻璃板時(shí)會(huì)破壞凝膠。
 
(2) 把玻璃板和墊片安裝在一起，把無(wú)凹口的玻璃板平放，并放上墊片，墊片的一端與凝膠的底部平齊，把帶凹口的玻璃板放在上面，硅烷化的一面朝里面，從頂部到底部夾緊，用黃色膠帶包住兩塊板的底部及兩側(cè)，去掉夾子。
 
(3) 灌制凝膠。把裝好的玻璃板放在吸水紙上，稍微傾斜以減小灌好后凝膠的靜力學(xué)壓力。配制一塊或兩塊 3.2% 的凝膠，按順序加下列物質(zhì)到 150 ml 的無(wú)菌燒瓶中：61.5 ml 室溫的水，4.8 ml 17X TP8，12.8 ml 丙烯酰胺儲(chǔ)存液。輕輕攪拌并慢慢加入 120 μl 1 mol/L 的乙酸鎂，120 μl TEMED 和 660 μl 10% APS。把混合液倒進(jìn)兩塊玻璃板形成的槽中直至液面到帶凹口玻璃板的頂部，插上梳子，使每個(gè)齒全部浸在凝膠中。螺絲鉗夾緊使玻璃板和梳子壓在一起，再倒一些凝膠在梳子上。讓凝膠在室溫聚合 1~4 h。
 
(4) 開(kāi)始剪接反應(yīng)前至少 1 h，在冷室中把凝膠裝在帶循環(huán)泵的電泳槽中。倒入電泳緩沖液，使玻璃板底部浸入 2.5 cm，凝膠頂部浸入至少 1 cm。安裝并使蠕動(dòng)泵的兩個(gè)管子與底部和頂部緩沖槽相連，使緩沖液從底槽向頂槽循環(huán)。用緩沖液輕輕地沖洗加樣孔。上樣前 160 V 預(yù)電泳半小吋，開(kāi)始電流為 12.5 mA，然后降到 11 mA 并保持恒流。
 
3. 基本剪接體的分析
 
(1) 準(zhǔn)備加有 R 緩沖液和競(jìng)爭(zhēng)性 RNA 的小管。加 6 μl 競(jìng)爭(zhēng)性 RNA 儲(chǔ)存液（20 μg/μl）到 60 μl R 緩沖液中，混合后各取 8.3 μl 分別加到 6 個(gè) 1.7 ml 的離心管中，離心管放在冰上。
 
(2) 按照順序在離心管中加入下列溶液以準(zhǔn)備剪接反應(yīng)（在冰上)：13.8 μl H2O，1 μl 100 mmol/L DTT，3 μl 1 mol/L 的磷酸鉀鹽緩沖液，5.0 μl 30% PEG8000，1.5 μl 0.1 mol/L MgCl2，1 μl 100 mmol/L ATP，20 μl 完整細(xì)胞提取物，混勻后離心 2 s。對(duì)于 0 時(shí)間點(diǎn)的樣品，取出 6.5 μl 反應(yīng)混合物加到含 R 緩沖液和競(jìng)爭(zhēng)性 RNA 的*管中，冰上放置（放射性標(biāo)記的前體 mRNA 以后要加到此樣品中）。
 
(3) 起始和終止剪接反應(yīng)。反應(yīng)混合物在 23℃ 水浴中放置 2~3 min，然后加入 5.5 μl 放射性標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白前體 mRNA。反應(yīng)體系中各成分的濃度分別為：60 mmol/L 磷酸鹽，3% (m/V) PEG6000，3 mmol/L MgCl2，2 mmol/L ATP，20 mmol/L KCl，8 mmol/L HEPES，80 μmol/L EDTA，2.2 mmol/L DTT，8% ( V/V) 甘油，0.4 nmol/L 前體 mRNA，40~80 μg 提取物。加入放射性標(biāo)記前體 mRNA 后，每 1 min 取出 7.5 μl 反應(yīng)液依次加到含有 R 緩沖液和競(jìng)爭(zhēng)性 RNA 的離心管中，樣品（R 緩沖液和競(jìng)爭(zhēng)性 RNA 中）保持在冰上，讓zui后取出的樣品（R 緩沖液和競(jìng)爭(zhēng)性 RNA 中）在冰上孵育 10 min，同時(shí)加 1 μl 放射性標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白前體 mRNA 到 0 時(shí)間點(diǎn)的樣品中，10 min 后，加 4 μl 冰冷的上樣緩沖液到每管樣品中，迅速混勻，冷室中離心 2 s。樣品上樣前一直要放在冰上。
 
(4) 上樣、電泳。上樣前關(guān)掉電源和循環(huán)泵，快速?zèng)_洗加樣孔，但加樣孔之間的凝膠條要保持直立。用平頭的微量吸頭每個(gè)樣品吸 15 μl，吸頭伸到加樣孔底部加樣，要避免碰到孔中的樣品。150~160 V 電泳 14~22 h，電泳 30 min 到 1 h 后打開(kāi)循環(huán)泵使緩沖液循環(huán)流動(dòng)。
 
(5) 取出凝膠。取凝膠前，剪兩張和無(wú)凹口玻璃板一樣大小的 Whatman 3 MM 濾紙，放在旁邊。關(guān)掉電源和循環(huán)泵，室溫拆下電泳裝置，去掉膠帶和墊片，小心取下帶凹口的玻璃板，凝膠會(huì)留在無(wú)凹口玻璃板。然后把一塊 3 MM 濾紙放在凝膠上，戴手套輕壓使 凝膠緊緊地和濾紙相連，在上面再放一張濾紙，翻轉(zhuǎn)帶凝膠的玻璃板，取下玻璃板，用濾紙托住凝膠。
 
(6) 使凝膠對(duì) X 射線片曝光。用塑料膜（plastic wrap) 包住凝膠和濾紙，在 -70℃ 對(duì) X 射線片曝光 ( 需增感屏）。凝膠可解凍/凍結(jié)數(shù)次，對(duì)幾張 X 射線片曝光。曝光后，凝膠可凍存在 -20℃ 用于以后的操作（干燥或把 RNA 轉(zhuǎn)移到尼龍膜上）。
 
(7) 多次曝光或?qū)α坠獍迤毓猓鼓z中的 RNA 沉淀并使凝膠干燥。去掉塑料膜和第二張濾紙，用足量的 15％ 甲醇和 5% 乙酸浸泡與一張濾紙結(jié)合的凝膠，室溫緩慢地振搖 20 min。凝膠和濾紙會(huì)分離，但一去掉固定液，二者就會(huì)結(jié)合。用帶真空泵的吸管慢慢吸掉固定液，戴手套輕輕地把凝膠和濾紙轉(zhuǎn)移到兩張的 3 MM 濾紙上。在凝膠干燥器中于 60℃ 干燥 45~60 min。
 
(8) 清潔電泳槽。電泳時(shí)，緩沖液槽的鉑絲會(huì)結(jié)上沉淀，擦拭并用去離子水沖洗以去掉沉淀，空氣干燥。
 
4. Nonhern 印跡分析內(nèi)源性 snRNP 復(fù)合物
 
(1) 采用非變性電泳分析 RNA 結(jié)合蛋白時(shí)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定使 RNA 復(fù)合物同其他的未結(jié)合的因子有效分離的條件是非常有必要的。如剪接依賴復(fù)合體中的前體 mRNA 能通過(guò) Northern 印跡與非結(jié)合的 snRNP 分開(kāi)。在zui初的實(shí)驗(yàn)中，剪接依賴的復(fù)合體可以被放射性標(biāo)記的前體 mRNA 示蹤，而非結(jié)合 snRNP 的位置可通過(guò)與 snRNP 特異探針的雜交來(lái)確定。在隨后的實(shí)驗(yàn)中確定哪種 snRNA 存在剪接依賴復(fù)合·體中，在非變性凝膠分析中采用有很低或沒(méi)有放射活性的轉(zhuǎn)錄物，但用于 Northern 印跡的凝膠處理則與這里所介紹的一樣。
 
(2) 處理凝膠 ( 使其適合轉(zhuǎn)移 RNA 到膜上）。凝膠對(duì) X 射線片曝光后，去掉塑料膜和第二張 3 MM 濾紙，把與*張濾紙結(jié)合的凝膠轉(zhuǎn)移到盛有足量 1X TBE、8 mol/L 尿素的耐熱玻璃盤中，液面高約 2 cm，室溫慢慢搖動(dòng) 15 min。小心地取出濾紙并用與真空泵相連的吸頭吸掉液體，小心操作，以防破壞凝膠，加入新的 1X TBE，8 mol/L 尿素，再搖 15 min，同時(shí)剪 4 張和凝膠相同大小的 3 MM 濾紙，15 min 后，將兩張 3 MM 濾紙托在凝膠下面，吸掉液體，保持盤面水平，使凝膠完整地放在濾紙上面。在 8 mol/L 尿素中浸泡對(duì)于 snRNA 和前體 mRNA 從復(fù)合體上地轉(zhuǎn)移到膜上是非常重要的。
 
(3) 把凝膠和尼龍膜裝在轉(zhuǎn)移裝置。讓尼龍膜先在水中浸濕，然后浸沒(méi)在 0.25X TBE 中。把凝膠、尼龍膜、濾紙等裝在電轉(zhuǎn)移裝置上 ( 注意方向，以使 RNA 從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上）。
 
(4) 在 115~120 V 電壓下轉(zhuǎn)移 1 h。轉(zhuǎn)移 1 h 后緩沖液的溫度會(huì)升到接近 37℃。
 
(5) 使 RNA 和膜交聯(lián)。拆下電轉(zhuǎn)移裝置，從膜上去掉濾紙和凝膠。用圓珠筆在膜上作一標(biāo)記以顯示轉(zhuǎn)移時(shí)與凝膠接觸的一面。迅速用新鮮的 0.25X TBE 漂洗以洗掉凝膠碎片，把尼龍膜放在一干凈的玻璃皿上，帶標(biāo)記的一面朝上。用一層塑料膜包住尼龍膜和玻璃皿。避免讓膜干燥，因?yàn)楫?dāng)膜是濕的時(shí)候 RNA 和膜zui容易交聯(lián)。把玻璃皿放在離紫外燈管 35 cm 處，打開(kāi)紫外燈照射 12 min。
 
(6) 使膜對(duì) X 射線片曝光以獲得放射性標(biāo)記前體 mRNA 的圖像并檢査轉(zhuǎn)移效率。如果在反應(yīng)中用了放射性標(biāo)記的前體 mRMA，可以用自顯影的方法檢査轉(zhuǎn)移的效率。讓膜在空氣中干燥 30~60 min，用一張 3 MM 濾紙托住尼龍膜，帶標(biāo)記的一面朝上。用一層塑料膜包住尼龍膜和濾紙，讓它在 -70℃ 對(duì) X 射線片曝光（放在壓片暗盒中）。
 
(7) 在低鹽和 SDS 中加熱以對(duì)尼龍膜進(jìn)行預(yù)處理。將 500~1000 ml 0.1X 印跡洗滌溶液加入一個(gè)硬質(zhì)耐熱玻璃盤中，用塑料膜蓋上，在微波爐中煮沸。小心地把膜浸沒(méi)在溶液中，蓋上塑料膜，在微波爐（低熱檔）中煮 10 min。室溫慢慢振搖 10 min。
 
(8) 預(yù)雜交。用兩張和尼龍膜一樣大小的 3 MM 濾紙夾住尼龍膜，一起放進(jìn)一個(gè)于的雜交袋中，小心地取出濾紙，膜留在袋中。在雜交袋中加入約 20 ml 雜交液（沒(méi)有探針）。把袋平放在桌面上，擠出全部氣泡（氣泡會(huì)阻止探針的雜交），然后封上雜交袋。在 42℃ 振搖水浴（慢搖）中孵育至少 1 h。
 
(9) 雜交探針的準(zhǔn)備見(jiàn)實(shí)驗(yàn)材料部分。從水浴中取出雜交袋，切開(kāi)一角，倒出雜交液。吸入含探針的雜交液，擠出氣泡（重要），密封雜交袋。在 42℃ 振搖水浴中孵育 12~24 h。
 
(10) 洗膜。切掉一角，把雜交液倒進(jìn)放射性廢液罐中。把雜交袋平放在幾塊紙巾上 ( 下面墊上吸水紙），切開(kāi)雜交袋，用平頭鑷子夾出雜交膜，放進(jìn)一個(gè)裝有 500 ml 3X 印跡洗液的硬質(zhì)玻璃盤中。室溫?fù)u 10 min，把洗液倒進(jìn)放射性廢液灌中，重復(fù)洗滌兩次。第四次洗滌加 500 ml 55°C 的 3X 印跡洗液，在 55℃ 水浴中揺 10 min。zui后一次洗膜加 500 ml 55℃ 的 0.1X 印跡洗液，55℃ 水浴搖 10 min。
 
(11) 曝光。從洗液中取出雜交膜，用 3 MM 濾紙吸干，空氣干燥 30 min~1 h。用一張 3 MM 濾紙托住雜交膜，帶標(biāo)記的一面朝上，用一層塑料膜包起來(lái)。放在壓片暗盒中于 -70℃ 對(duì) X 射線片曝光 12 h~5 天。
 
(12) 去掉探針并以另一探針雜交。雜交膜依次至少可和 6 種探針雜交。曝光后，可以用步驟 (7) 的方法去掉原先的探針。要檢查探針去除的效率，可以在用下一種探針雜交之前讓膜在空氣中干燥，然后對(duì) X 射線片曝光。