酵母單雜交技術(shù)的原理、基本操作和用途

【資料簡(jiǎn)介】

酵母單雜交 技術(shù)是一種研究蛋白質(zhì)和特定DNA序列相互作用的技術(shù)方法，主要包括四個(gè)流程即：一、篩選還有報(bào)告基因的酵母單細(xì)胞株；二、構(gòu)建表達(dá)文庫(kù)；三、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞；四、陽(yáng)性克隆菌株的篩選。

1.酵母 單雜交的基本原理

酵母單雜交技術(shù)是1993年由酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來(lái)的，其基本原理為：真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由一個(gè)DNA 特異性結(jié)合功能域和一個(gè)或多個(gè)其他調(diào)控蛋白相互作用的激活功能域組成，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA—bindingdomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過(guò)程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可*獨(dú)立地發(fā)揮作用。據(jù)此，我們可將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為文庫(kù)蛋白編碼基因，只要其表達(dá)的蛋白能與目的基因相互作用，同樣可通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，啟動(dòng)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。

酵母單雜交原理示意圖

2.酵母單雜交技術(shù)的特點(diǎn)

酵母單雜交體系自1993年由Wang和Reed創(chuàng)立以來(lái)，在生物學(xué)研究領(lǐng)域中已經(jīng)顯示出巨大的威力。應(yīng)用酵母單雜交體系已經(jīng)驗(yàn)證了許多已知的DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了新的DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，并由此找到了多種新的轉(zhuǎn)錄因子。近來(lái)，已有應(yīng)用酵母單雜交體系進(jìn)行疾病診斷的研究報(bào)道。隨著酵母單雜交體系的不斷發(fā)展和完善，它在科研、醫(yī)療等方面的應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越廣泛。采用酵母單雜交體系能在一個(gè)簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，識(shí)別與DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，同時(shí)可直接從基因文庫(kù)中找到編碼蛋白的DNA序列，而無(wú)需分離純化蛋白，實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單易行。由于酵母單雜交體系檢測(cè)到的與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)是處于自然構(gòu)象，克服了體外研究時(shí)蛋白質(zhì)通常處于非自然構(gòu)象的缺點(diǎn)，因而具有很高的靈敏性。目前，多種酵母單雜交體系的試劑盒和相應(yīng)的cDNA文庫(kù)已經(jīng)商品化，為酵母單雜交體系的使用提供了有利的條件。

但酵母單雜交也存在以下缺點(diǎn)：有時(shí)由于插入的靶元件與酵母內(nèi)源轉(zhuǎn)錄激活因子可能發(fā)生相互作用，或插入的靶元件不需要轉(zhuǎn)錄激活因子就可以激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，因此往往產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。如果酵母表達(dá)的AD融合蛋白對(duì)細(xì)胞有毒性，或融合蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)不能穩(wěn)定地表達(dá)，或融合蛋白發(fā)生錯(cuò)誤折疊，或者不能定位于酵母細(xì)胞核內(nèi)，以及融合的Gal4AD封閉了蛋白質(zhì)上與DNA相互作用的位點(diǎn)，則都可能干擾AD融合蛋白結(jié)合于靶元件的能力，從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3.酵母單雜交的基本操作過(guò)程

(1)設(shè)計(jì)含目的基因(稱為誘餌)和下游報(bào)告基因的質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞。

(2)將文庫(kù)蛋白的編碼基因片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人同一酵母中。

(3)若文庫(kù)蛋白與目的基因相互作用，可通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)將文庫(kù)蛋白的編碼基因篩選出來(lái)。在這里作為誘餌的目的基因就是啟動(dòng)子DNA片段，文庫(kù)基因所編碼的蛋白就是啟動(dòng)子基因結(jié)合蛋白。

4.酵母單雜交技術(shù)的用途

迄今為止，應(yīng)用酵母單雜交體系已經(jīng)識(shí)別并驗(yàn)證了許多與目的DNA序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，同時(shí)單雜交技術(shù)還被應(yīng)用于識(shí)別金屬反應(yīng)結(jié)合因子。正向與反向單雜交體系的結(jié)合，還可用于篩選阻礙DNA與蛋白質(zhì)相互作用的突變的單個(gè)核苷酸。

目前，在研究DNA—蛋白質(zhì)相互作用中，酵母單雜交體系主要有以下3種用途：①確定已知DNA—蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用;②分離結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點(diǎn)蛋白的新基因;③定位已經(jīng)證實(shí)的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及準(zhǔn)確定位與DNA結(jié)合的核苷酸序列。

酵母單雜交是在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，酵母單雜交主要用于研究蛋白質(zhì)和DNA的相互作用，而酵母雙雜交主要是用于研究蛋白質(zhì)間的相互作用。