IgG的分離與提純實驗

【資料簡介】

實驗方法原理    
硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質。用此方法可以將主要的免疫球從樣品中分離，是免疫球蛋白分離的常用方法。高濃度的鹽離子在蛋白質溶液中可與蛋白質競爭水分子，從而破壞蛋白質表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。各種蛋白質的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質。這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數小和不易使蛋白質變性而應用zui廣。
 
實驗材料    動物血清樣品
試劑、試劑盒    硫酸銨NH4OHPB液BaCl2溶液納氏液洗脫液生理鹽水
儀器、耗材    透析袋離心機燒杯攪拌棒
實驗步驟    
一、材料與試劑配制 
 
1.  動物血清
 
2.  硫酸銨飽和溶液
 
硫酸銨：800 g~850 g
 
H2O ：1 000 ml
 
加熱至絕大部分溶質溶解為止，趁熱過濾，置室溫，然后以28% NH4OH調pH至7.0（不調pH值也可以）。
 
注：硫酸銨以質量優者為佳，因次品中含有少量重金屬對蛋白質巰基有影響。如次品必須除去重金屬，可在溶液中通入H2S，靜置后濾過，加熱蒸發H2S即可。
 
3.  0.01 mol/L pH7.4 PB液
 
A液：0.10 mol/L NaH2PO4液
 
NaH2PO4·2H2O ：15.60 g
 
加H2O至1 000 ml
 
B液：0.10Mol/L Na2HPO4液
 
Na2HPO4·12H2O： 35.80 g
 
加H2O至1 000 ml
 
取A液19 ml，B液81 ml加水至1 000 ml即可。
 
4.  1%BaCl2溶液
 
5.  納氏液
 
HgI ：115.00 g
 
KI： 80.00g
 
加H2O至500.00 ml
 
溶化后過濾，然后再加20%NaOH 500.00 ml，混合即可。
 
6、0.50 mol/L的HCl液和0.50 mol/L的NaOH液
 
7、洗脫液
 
0.03 mol/L的NaCl液。
 
8、透析袋（或玻璃紙）
 
二、操作方法 
 
1.  取20 ml血清，加生理鹽水20 ml，再逐滴加入（NH4）2SO4飽和溶液10 ml，使成20%（NH4）2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30 min。
 
2.  3 000 r/min離心20 min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。
 
3.  在上清液中再加（NH4）2SO4飽和溶液30 ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，充分混合，靜置30 min。
 
4.  3 000 r/min離心20 min，棄上清。
 
5.  于沉淀中加20 ml生理鹽水，使之溶解，再加（NH4）2SO4飽和溶液10 ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合后，靜置30 min。
 
6.  3 000 r/min離心20 min，棄上清，以除去白蛋白。重復步驟5，2~3次。
 
7.  用10 ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。
 
8.  透析除鹽，在常水中透析，再在生理鹽水中于4℃透析24 h，中間換液數次。
 
以1%BaCl2檢查透析液中的SO4 2-或以納氏試劑檢查NH4 （取3~4 ml透析液，加試劑1~2滴，出現磚紅色即認為有NH4 存在），直至無SO4 2-或NH4 出現為止。也可采用SephadexG25或電透析除鹽。
 
9.  離心去沉淀（去除雜蛋白），上清液即為粗提IgG （即γ球蛋白，如以36%的飽和硫酸銨沉淀血清的產物即為優球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白）。
 
10.  過DEAE－纖維素層析柱。以0.01 mol/L pH7.4 PBS（0.03 mol/L NaCl）洗脫，收集洗脫液。也可采用SephadexG150或G200柱。
 
11.  蛋白質及其定量鑒定。
 
12.  IgG的純度鑒定可采用下列方法之一鑒定。
 
（1）區帶電泳
 
玻片瓊脂或醋酸纖維膜電泳均可。加樣電泳后，只在γ—球蛋白的遷移部位出現一條帶。操作時，同時可用全血清樣品，不同濃度（NH4）2SO4鹽析樣品進行電泳，以資比較。
 
（2）瓊脂雙相雙擴散鑒定
 
預先準備該IgG免疫異種動物所獲的抗IgG血清。將IgG與抗IgG血清進行雙相雙擴散，如IgG提純的話，則在兩樣品孔之間出現一條沉淀線。
 
（3）免疫電泳鑒定
 
孔內加待測樣品，電泳后，在槽內加抗IgG血清，瓊脂擴散24h，觀察結果。如果提取的IgG純的話，則只出現一條弧形的沉淀線，且沉淀線位于γ—球蛋白區。此鑒定必須同時進行全血清及抗血清抗體的免疫電泳，以資比較。
 
（4）圓盤電泳鑒定
 
用全血清樣品及提純樣品同時進行圓盤電泳。全血清樣品在圓盤電泳上出現數十條區帶，而純化的IgG則只有一條區帶。
 
13.  IgG的濃縮與保存
 
（1）IgG的濃縮
 
（2）IgG的保存
 
一般濃縮至1%以上的濃度，再分裝成小瓶凍干保存，或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低溫冰箱保存，注意防止反復凍融。