血基因組DNA提取實驗

【資料簡介】

實驗方法原理    本試劑盒采用特殊的細胞裂解和蛋白去除液（包括蛋白酶K 裂解）從抗凝全血中得到基因組DNA。適用于從凍全血、血漿、血清、骨髓、其他體液、淋巴細胞、培養細胞、病毒和線粒體中提取DNA。
實驗材料    抗凝全血
試劑、試劑盒    血基因組DNA 試劑盒
儀器、耗材    96孔深孔板96圓孔板96孔DNA制備板96圓孔硅膠片BF-400膜
實驗步驟    
一、試劑盒組成、貯存、穩定性 
 
1.  說明書，耗材：96孔深孔板（1.6 ml），96圓孔板，96孔DNA制備板，96圓孔硅膠片，BF-400膜。
 
2.  Proteinase K：凍干的蛋白酶K 可室溫貯存6 個月，長時間保存請置于4℃；溶解后，在2-8℃可貯存2 個月，長時間保存請勿置于室溫中。
 
3.  Buffer PK ：蛋白酶K 溶解液，室溫密閉貯存。
 
4.  Buffer BL ：細胞裂解液，室溫密閉貯存。
 
5.  Buffer W1B concentrate ：洗滌液。使用前，根據瓶上數量加入乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存。可用*乙醇或95%乙醇。
 
6.  Buffer W2 concentrate ：去鹽液。使用前，根據瓶上數量加入乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存。可用*乙醇或95%乙醇。
 
7.  10×Buffer W2（12×96 試劑盒）：用于配制Buffer W2 。
 
8.  Eluent B：7.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，0.3 mM EDTA ，室溫密閉貯存。
 
二、實驗準備 
 
1.  *次使用時，在Buffer W2 concentrate 和Buffer W1B concentrate 中按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。
 
2.  Buffer W2（12×96 試劑盒）配制：在提供的500 ml 空瓶中加入15 ml 10×Buffer W2，135 ml 去離子水和350 ml 乙醇，可用*無水乙醇或95%乙醇。
 
3. 根據瓶上標簽將蛋白酶K 溶解于Buffer PK 中，請勿旋渦振蕩。
 
4. 準備70℃溫浴。
 
5. 使用前檢查Buffer BL 是否有沉淀析出，若出現沉淀，請于70℃溫浴加熱至沉淀*溶解后再使用。
 
三、操作步驟 
 
1.  向96 圓孔板的每孔中加入20 μl 蛋白酶K。
 
2.  加200 μl 抗凝全血到96 圓孔板中。
 
* 若全血樣品體積少于200 μl，用PBS 補充到200 μl。
* 若樣品為鳥類血，樣品用量須低于10 μl。
* 若需得到RNA-free 的基因組DNA，在步驟3 加入Buffer BL 前加入DNase-free 的RNase A(20 mg/ ml) 。
 
3.  加200 μl Buffer BL ，注意不要打濕每孔的邊緣，用96 圓孔硅膠片密封各孔。
 
4.  用力混合30 s。
 
5. 3000 rpm 簡短離心使96 圓孔硅膠片上的溶液到96圓孔板內。啟動離心機，當速度達到3000rpm后即停止。
 
6. 在培養箱或烘箱中70℃溫浴至少10 min。
 
7.  3 000 rpm 簡短離心使96 圓孔硅膠片上的溶液到96圓孔板內。啟動離心機，當速度達到3 000rpm后即停止。
 
8. 取下96 圓孔硅膠片，每孔加入200 μl 乙醇（96-*）。
 
9.  用96 圓孔硅膠片密封各孔，用力混勻混合15 s。3 000 rpm 簡短離心使96 圓孔硅膠片上的溶液到圓孔板內。啟動離心機，當速度達到3 000 rpm 后即停止。
 
10.  將96 孔DNA 板放到一潔凈的96 孔1.6 ml 深孔板。取下圓孔板上的96 圓孔硅膠片，將每孔中的溶液轉移至96 孔DNA 板 中，6 000 rpm 離心4 min。
 
11.  丟棄96 孔1.6 ml 深孔板的濾液，將96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入500 μl Buffer W1B，用一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板，6 000 rpm 離心4 min。
 
* 確認在Buffer W1B concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。
 
12.  丟棄96 孔1.6 ml 深孔板的濾液，將96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入850 μl Buffer W2，用另一新 的BF-400膜密封96孔DNA板，6 000 rpm 離心4 min。
 
* 確認在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。
 
13.  棄濾液，將96孔DNA板放回到96孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入400 μl Buffer W2， 用另一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板，6 000 rpm 離心4 min。
 
14.  將96孔DNA板放在一潔凈的96 孔1.6 ml 深孔板上，用BF-400膜密封96孔DNA板，6 000 rpm離心15 min。
 
15.  將96孔DNA板放在另一潔凈的96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入100-200 μl Eluent B 或去離子水，室溫靜置2 min，用另一新的BF-400膜密封96 孔DNA板，6 000 rpm 離心4min洗脫得到DNA。
 
收起 
注意事項    
 1.  Buffer BL 和Buffer W1B 含刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套和眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，謹防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時，要立即用大量清水和生理鹽水沖洗，必要時尋求醫療咨詢。