蛋白質(zhì)雙向電泳過程與體會(huì)

【資料簡(jiǎn)介】

雙向電泳IEF (sigma) IEF（not IPG）/SDS-PAGEzui簡(jiǎn)單的裝備如下，適合于沒多少money做IPG又想做“熱”的所謂蛋白質(zhì)組的.

IEF用Biorad的圓盤電泳槽（不行用國(guó)產(chǎn)的吧，不），SDS-PAGE用六一廠的就可以了(六一的，買進(jìn)口電泳槽的錢留出來測(cè)搞出的差異蛋白質(zhì)的序列吧）

BIO－RAD 的圓盤電泳槽，國(guó)產(chǎn)的不，因?yàn)樯喜跙iorad 的鉑金絲凹進(jìn)去了一點(diǎn)，不是很進(jìn)去，而國(guó)產(chǎn)的凹得太進(jìn)去了以至于電聚焦時(shí)產(chǎn)生的氣泡繞在鉑金絲一圈，影響電聚焦。

雙向電泳

蛋白質(zhì)樣品制備

秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal 等（1986）的方法進(jìn)行。100mg 材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM 即0.07%β- 巰基乙醇），混勻，-20℃沉淀1 小時(shí)，4℃，15000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇)，再于-20℃沉淀1小時(shí)，同上離心棄上清，（有必要再用80%丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。

按每mg干粉加入20μl（可調(diào)）UKS液[9.5 M尿素，5mM 碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫蘇糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃育30min，期間攪動(dòng)幾次，28度 （溫度低，高濃度的尿素會(huì)讓溶液結(jié)冰）16000 r/min離心15 min，離心力越大時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)越好！上清即可上樣電泳。或者-70度保存 。

2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

按Garrels（1983）的程序，稍加改動(dòng)。10μl上述用UKS液制得的蛋白質(zhì)樣品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸，冰浴30min后，4℃，4000 r/min離心15min，棄上清，再加入100μl冷丙酮，同上離心5min，棄上清，凍干沉淀，用100μl PBS溶液復(fù)溶，并按Bradford（1976）的程序測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。說實(shí)話，好象Bradford法不太好做 。

2.3.1 電聚焦（IEF）

2.3.1.1 玻管準(zhǔn)備

干凈玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部，在16cm處作好標(biāo)記,垂直放在泡沫板上。電聚焦的管子，買原裝的也可以，實(shí)在不行自己也可以做的，1ml 的移液管，內(nèi)徑1.5mm左右的，長(zhǎng)度取18cm，用玻璃刀做，呵呵，很容易的；玻璃管的處理，先用2M 的NaOH 泡 至少 1hr，用自來水沖后;用雙蒸水沖，用雙蒸水泡至少1hr，中間至少換2，3 次水;后用2M的HCL 泡至少1 個(gè)小時(shí)，用雙蒸水沖，（不能用自來水沖），然后雙蒸水泡至少1 個(gè)小時(shí)，中間換3，4 次水，可多泡一會(huì)。zui后泡在無水乙醇里 面1hr，轟干就可以用了.

2.3.1.2 凝膠制備與電聚焦灌IEF的配方為

3.09克尿素

1.125 ml 10%NP-40

1.125ml 水

0.735ml 30%屏息現(xiàn)案 (ACR 28.38 BIS 1.62)

0.15 ml Am 3.5-10

0.375ml Am 5-7

8衛(wèi)生 10%AP

1.8衛(wèi)生 TEMED

用注射器吸好膠液，裝上7號(hào)針頭，將7號(hào)針頭插入玻管底部，邊推注射器邊提針頭，直到標(biāo)記處，用微量進(jìn)樣器小心加入少量水，可見明顯的界面出現(xiàn)，讓其聚合1小時(shí)以上，適當(dāng)長(zhǎng)一點(diǎn)的時(shí)間好一些，我一般是頭天下午灌膠，第2 天下午才開始跑電泳。待膠聚合好后，除去Parafilm并吸去頂部的覆蓋液，加樣80μg，上面再小心加入50m mol/l NaOH至管口,不要破壞樣品與NaOH 的界面。即可進(jìn)行電泳。電極液為：上槽（負(fù)極）為50m mol/l NaOH 液，下槽（正極）為25m mol/l H₃PO₄。按200V×15min，300V× 30min，400V×18h，1000V×1h的程序進(jìn)行電聚焦。或者直接400V 17hr 1000V 2hr very important thing is跑*向一定要在保持在37 度左右,特別是冬天,我的方法是 溫控儀控制 暖風(fēng)機(jī) 在37 度 暖風(fēng)機(jī)和電泳槽在一個(gè)大的紙箱(密封)里.呵呵,應(yīng)該可以想象得到吧,*向溫度特別重要,不然,電聚焦肯定做不好。

2.3.1.3 電泳后的凝條處理

電聚焦完畢后，用注射器吸滿水，套上一個(gè)200μl的槍頭，當(dāng)然槍頭與注射器間用parafilm封住防漏氣。從頂部向下注水使膠條向下滑出。當(dāng)然，剛開始做的時(shí)候肯定不熟，很不爽，有時(shí)候你會(huì)唱 想哭卻又哭不出來，呵呵，熟悉了就快了，注射器 槍頭 玻璃管必須為一直線，消息不要把注射器的頭搞斷了。取一膠條，用雙蒸水洗凈兩端，按酸端到堿端的順序切成0.5cm 的小段，各自浸入含1.3ml 抽氣后雙蒸水的Eppendorf管中過夜，次日用酸度計(jì)分別測(cè)定各段的pH值，以凝膠長(zhǎng)度為橫坐標(biāo)，pH值為縱坐標(biāo)作圖，即為等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。漫漫擠,管子,200 衛(wèi)生槍頭,注射器,要成一直線,,要用一手扶著管子,一手拿住200 衛(wèi)生槍頭,保證水不從槍頭和管子處流出來, 注射器頂在胸前把膠條擠出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久，想什么時(shí)候跑SDS-PAGE就什么時(shí)候跑。絕招哦,不要隨便亂傳,嘿嘿！還可以馬上看一下,膠條上有蛋白質(zhì)沒有,有的話一下就可以看見了。那些說什么放在平衡液里,-20 度的,肯定不行,呵呵！就跟你用考染IEF 膠條一樣的,帶,可能先在12%的TCA 里面看不見,不過你再把它放在水里面,泡一會(huì)帶就出來了。不過在平衡之前,要用dd water泡30min,而且要換至少5 次水,每次用不同的小平皿。

注意到下級(jí)液磷酸部分的膠條沒，是不是有一節(jié)約2cm左右，比較突出，沒有膨大的部分呀！只是在tca泡的時(shí)候磷酸段有一小截變白的速度比較慢，大約3cm左右，呵呵!

對(duì)要進(jìn)行第二向SDS-PAGE 的膠條則必須用平衡液[2.3%SDS，62.5m mol/L Tris-HCL（pH6.8），10%甘油，5%β－巰基乙醇，0.1%溴酚藍(lán)]進(jìn)行二次平衡，*次20min，第二次25min。第2 次的溶液為新的。一般我是把第2次用過的當(dāng)成*次的用 。平衡過程中每隔幾min輕輕的晃一下小平皿。

2.3.2 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

選用DYY-Ⅲ型（北京六一儀器廠生產(chǎn)）電泳槽（規(guī)格為200×200×1mm），分離膠濃度為12%，無濃縮膠。待膠聚合后，將電聚焦后已經(jīng)平衡的膠條平放于濃縮膠頂端（避免膠條拉直），并用1%瓊脂糖（電極緩沖液配制）封膠，特別應(yīng)注意避免膠條與分離膠上沿產(chǎn)生氣炮。61廠板子之灌膠：堅(jiān)決不用凡士林，用透明膠將兩端（板子的2 邊）封住，再用2%瓊脂之SDS-PAGE 電極液封底，待瓊脂凝固后再灌膠，zui后用水封膠。over！

做之前，一定要保證，1，灌膠不會(huì)有任何問題，不能漏，2，不用濃縮膠，只用分離膠。3，分離膠用水封，要保證凝聚好的PAGE 膠，為一平的線，凹來凸去的就不要用了。玻璃版能用硅化劑不過了。防止從邊上漏，我用透明膠（約4cm寬），封住兩邊，下面還是用2％的瓊脂封。灌好電極緩沖液[25m mol/LTris，192m mol/L 及0.1%SDS]，按25mA/板膠恒流進(jìn)行電泳，待溴酚蘭離底部1cm時(shí)即可停止電泳，一般電泳耗時(shí)約4-5h。銀染：凝膠于40%甲醇，10%醋酸中固定1h以上或者過夜；用水洗1次,5min;30%乙醇洗2×20min；水洗6×5min； 0.02%1min；水洗3×20s；0.2%，0.02%甲醛快速的潤(rùn)洗一次,就是過一下的意思,到這個(gè)溶液進(jìn)去,馬上又倒掉;0.2%，0.02%甲醛20min；水洗3×20s；顯色液(3%碳酸鈉，0.05%甲醛，0.0005%)快速的潤(rùn)洗一次,就是過一下的意思,到這個(gè)溶液進(jìn)去,馬上又倒掉;顯色液(3%碳酸鈉，0.05%甲醛，0.0005%)顯色到你所希望的程度,自己看,背景好,點(diǎn)又多的話就可以了；水洗20秒；0.05%停顯。染色理想溫度：我去年4,5月時(shí),通常染色都定在中午,12點(diǎn)多;溫度是20 度左右,(這個(gè)溫度我也沒控制的)TCA領(lǐng)一瓶TCA 500g的那種 按分子克隆上的好象是直接加200多ml 水就成TCA了10%TCA, 0.07%2-ME 丙酮 （100ml）:

TCA 10ml

2-ME 0.07ml

丙酮 90ml

0.07%2-ME 丙酮 （100ml）:

2-ME 0.07ml

丙酮 100ml

0 Farrel 液(9.5M Urea,2%NP-40,0.4%Am3.5~10,1.6%5~7,5% 2-ME)

50ml

Urea 28.5g

NP-40 1ml

Ampholine 5~7 2.0ml

3.5~10 0.5ml

2-ME 2.5ml

注意定容！配好后用1.5ml 管分裝！-70度保存

注意 這兩個(gè)溶液 配的時(shí)候 比如配 50ml 用100ml的燒杯 用量筒量50ml 水 倒如燒杯里面，用記號(hào)筆標(biāo)上刻度，然后把水倒掉，再稱 尿素 小量加水，因?yàn)槟蛩丶铀篌w積會(huì)變大，再37 度水域鍋里溶，然后加其它成分，zui后再定到50ml

(2002-10-30 18:39:37)

UKS液 (含9.5M Urea, 5mMK2CO3,1.25%SDS,0.5%DTT,2%Ampholine(3.5~10),6%Triton X-100)

25ml 50ml

Urea 14.25g 28.5g

K2CO3 17.25mg 34.5mg

SDS 0.3125g 0.625g

DTT 0.125g 0.25g

2-ME

Ampholine(3.5~10) 1.25ml 2.5ml

Triton X-100 1.5ml 3ml(0.86ml 2 槍，4槍)

2-ME 可適當(dāng)加一些！注意定容！配好后用1.5ml管分裝！-70度保存