人血栓前體蛋白（TpP）試劑盒操作步驟說明

【資料簡介】

人血栓前體蛋白（TpP）試劑盒操作步驟說明

本試劑僅供研究使用  標本：血清或血漿

試驗原理：
人血栓前體蛋白TpP試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知TpP濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將TpP和標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中TpP的濃度呈比例關系。

操作注意事項
． 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。
2． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。
3． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6． 洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7． 底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
8． 加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9． 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法
、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，000×g離心0分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、 血漿-----人血栓前體蛋白TpPEDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、 細胞上清液---000×g離心0分鐘去除顆粒和聚合物。
4、 保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備
． 標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
40 ug/ml （6號標準品） 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
20 ug/ml （5號標準品） 00ul的原倍標準品加入00ul的標準品稀釋液
0 ug/ml （4號標準品） 00ul的5號標準品加入00ul的標準品稀釋液
5.0 ug/ml （3號標準品） 00ul的4號標準品加入00ul的標準品稀釋液
2.5 ug/ml （2號標準品） 00ul的3號標準品加入00ul的標準品稀釋液
.25 ug/ml （號標準品） 00ul的2號標準品加入00ul的標準品稀釋液
0 ug/ml （空白對照） 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2． 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟
． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。
2． 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。
3． 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育小時。
4． 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6． 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育0分鐘。避免光照。
8． 取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。

人血栓前體蛋白TpP試劑盒性能
. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應。
3. 重復性：板內、板間變異系數均小于0%。

結 果 判 斷 與 分 析
、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的TpP標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的TpP含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

3、檢測值范圍：0-40ug/ml

4、敏感度： 0. ug/ml