酶免疫電鏡技術

【資料簡介】

酶免疫電鏡技術
 

（一）  原理 
酶免疫電鏡技術是利用酶的率的催化作用對其底物的反應形成不同的電子密度，借助于電子顯微鏡觀察，證明酶的存在，從而對抗原進行定位。
（二）材料與試劑
1．PBS液  取NaCl 8.5g，Na2HPO40.85g，KH2PO40.54g，加水至1 000ml即可。
2．DAB溶液  取5mgDAB（3、3二氨基聯苯胺）加入10mlTris－HCl緩沖液（0.05mMol/L pH 7.6），加1%H2O20.5ml～1ml。配制時，避光進行，現用現配。在顯色完成沖洗過程中，要保持流水沖洗，防止非特異性物質積于標本上。
3．戊二醛固定液  取50ml 0.2Mol/L PBS緩沖液與25%戊二醛按以下比例配制：
0.2Mol/LPBS液         50     50    50    50    50
25%戊二醛（ml）        4     6     8     10    12
重蒸餾水（ml）         46    44    42    40     28
固定液終濃度（%）     1.0    1.5   2.0    2.5    3.0
（三）操作方法
1．酶標抗體的制備  疫酶技術章。
2．取材 將培養細胞或懸浮細胞用0.1Mol/L PBS液沖洗，離心沉淀后，立即轉入固定液（2%甲醛液或2%戊二醛液均可）pH 7.2，4℃固定5min～30min（依抗原性質所定）。如病料為組織塊，則取適當大小，先固定1h然后取出，以新的雙面刀片切成50～100μm的薄組織再行固定1h～2h。
3．漂洗  以PBS液漂洗過夜，換液3～4次。
4．血清孵育，25℃1h或4℃過夜，孵育的標本放置于加蓋的瓷盤內，底層墊數層紗布。防止抗血清干燥凝固，不易洗脫，造成非特異性吸附。
5．PBS沖洗3～4次，每次10min。
6．2.5%戊二醛再固定15min～30min。
7．PBS液沖洗3～4次每次10min。
8．酶標記抗體孵育；用適當稀釋的酶標抗體（即工作濃度）于25℃濕盆內孵育1h或4℃過夜。
9．PBS液沖洗3～4次每次10min或4℃漂洗過夜。
10．酶顯色處理  將漂洗后的標本浸入DAB－H2O2底物溶液中，20℃，10min～30min。顯色強弱與戊二醛的固定有關。若顯色弱則可減少甚至取消戊二醛的固定時間。沖洗時必須注意防止非特異漂浮的沉積。
11．常規包埋、切片、電鏡觀察  在經過脫水包埋確定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做標記染色，切片一般在2μm～4μm，切片后染色不存在通透困難的問題。無論在標記染色后切片還是在切片后標記染色，在光鏡下定位選擇后，再做電鏡定位包埋，這樣目的性強，可減少工作量。
（四）結果判定
在已知陽性、陰性樣品成立的前提下，凡出現棕色顆粒，即指示抗原抗體的存在，同時可觀察到病毒顆粒的存在，判為陽性（＋），否則判為陰性（－）。