單克隆抗體制備技術方法

【資料簡介】

一、單克隆抗體的產生 
    經過反復克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株應立即擴大培養(除及時凍存的細胞外)。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細胞產生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株制備單克隆抗體。 
    大量制備單克隆抗體的方法有兩類：一類是動物體內誘生法，另一類是體外培養法。 
    (一).動物體內誘生法
　　接種動物常選用BALB/c小鼠或與BALB/c小鼠雜交的Fl代小鼠。接種前l周左右，于小鼠腹腔內注入降植烷或醫用液狀石蠟0.5ml。每次小鼠腹腔注射0.5×10⁶～1×10⁶個雜交瘤細胞。接種后7～10天，小鼠腹部逐漸長大，誘生出腹腔腫瘤并產生含單克隆抗體的腹腔積液。接種后10～14天，可分次采集腹腔積液，1只可得10～20ml(5～20mg/m1)。收集到的腹腔積液，離心去除細胞，滅活(56℃、30min)，再次離心，取上清液，加入0.1%疊氮鈉，分裝保存于-20℃。如凍干保存，抗體效價可保持更久。 
    (二).體外培養法 
    將雜交瘤細胞接種到培養瓶中，在5%C02，37℃孵箱中培養數天后，收集上清液，離心去除細胞和碎片。本法所得抗體含量不高，為5～25pg/ml。但仍可滿足部分實驗的要求。另一種是雜交瘤細胞高密度培養，分兩種類型：一類是懸浮培養系統，即采用轉瓶或發酵罐式的生物反應器；另一類是細胞固定化培養系統，包括中空纖維細胞培養系統和微囊化細胞培養系統。高密度培養可使單位體積單克隆抗體含量明顯增加，產量可達lg/L。 
    二、單克隆抗體的純化 
    從培養液或腹腔積液獲得的單克隆抗體，不需要純化即可應用于日常診斷或定性研究。由于其中含有大量來自培養基、宿主或克隆細胞本身的一些無關蛋白，如果用于免疫標記測定，如放射性核素、酶、熒光素或*標記等，必須進一步分離和純化。無論培養液、腹腔積液或血清，均可先用半飽和、飽和硫酸銨進行沉淀，達到初步濃縮和純化的目的。經過適當溶解和充分稀釋后，可用親和層析法進一步純化。 
    三、單克隆抗體的性質鑒定 
    當獲得多個雜交瘤細胞株時，要了解哪一株是zui適用的，則一定要通過各種鑒定。常見的方法有：
    (一)Ig類型測定 
    通常以免抗小鼠Ig類及亞類抗體與培養液中單克隆抗體按雙向瓊脂擴散法進行測定，確定其Ig類型或Ig亞類型別。 
    (二)特異性測定 
    把與相應抗原有關的物質同McAb進行多種免疫學檢測，鑒定McAb的特異性。這直接關系到McAb應用的可靠性。 
    (三)抗體效價測定 
    效價以腹腔積液或培養液的稀釋度表示，稀釋度越高，則抗體效價也越高。在凝集反應中，腹腔積液效價可達5萬以上；在ELISA中，腹腔積液效價可達100萬以上。如ELISA效價低于10萬，用于診斷測定將不會達到很高的敏感度，應重新制備。 
    (四)表位測定 
    通過雙向瓊脂擴散法，把兩種McAb混合，加入于同一孔中，對孔放相應的抗原，如出現兩條沉淀線可證明兩者為抗不同表位的McAb；利用ELISA雙抗夾心法，將一種McAb作包被抗體，另一作酶標記，其中加入抗原，如顯色，則證明兩者抗不同的表位。 
    (五)親和力測定 
    只有當抗原與抗體結合部位結構*吻合時，抗體的親和力zui大。這種結合力以抗原抗體反應平衡時，抗原與抗體濃度的乘積與抗原抗體復合物濃度之比表示。如親和力太低，會嚴重影響測定的敏感性。 
    (六)染色體分析 
    正常鼠的脾細胞染色體數：40，全部為端著絲粒；小鼠骨髓瘤細胞染色體：SP2/0細胞為62～68，NS-1為54～64。大多數為非整倍性，有中部和亞中部著絲點。雜交瘤細胞的染色體數目接近兩親本細胞染色體數目的總和，在結構上多數為端著絲粒染色體外．還應出現少數標志染色體。染色體數目多且較集中的雜交瘤細胞分泌價的抗體。