雜交種類

【資料簡介】

隨著基因工程研究技術的迅猛發展，新的核酸分子雜交類型和方法在不斷涌現和完善。核酸分子雜交可按作用環境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型：
　　（1）固相雜交
　　將參加反應的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應核酸游離在溶液中。固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。由于固相雜交后，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測和能防止靶DNA自我復性等優點，所以zui為常用。常用的固相雜交類型有：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。
　　（2）液相雜交

所參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中，一種研究zui早且操作復合的雜交類型，在過去的30年里雖有時被應用，但總不如固相雜交那樣普遍。主要缺點是雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。近幾年由于雜交檢測技術的不斷改進，商業性基因探針診斷盒的實際應用，推動了液相雜交技術的迅速發展。
　　固相膜核酸分子雜交

（1）菌落原位雜交（Colonyinsituhybridization）
　　將從培養平板轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA，再烘干固定DNA于膜上，與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。
　　（2）斑點雜交（Dotblotting）
　　該方法是將被檢標本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。為使點樣準確方便，市售有多種多管吸印儀（manifolds），如MinifoldI和II、Bio-Dot（Bio-Rad）和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀，反復沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標本，這時的膜就可以進行雜交。
　　（3）Southern印跡雜交（Southernblotting）

是研究DNA圖譜的基本技術，在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產物分析等方面有重要價值。基本方法是將DNA標本用限制性內切酶消化后，經瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過毛吸作用將DNA從中轉印至硝酸纖維素濾膜（尼龍膜也較長用）上，烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對位置轉移到濾膜的過程中繼續保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標記的探針雜交，利用放射自顯影術確定探針互補的每條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

（4）Northern印跡雜交（Northernblotting）

DNA印跡技術由Southern于1975年創建，稱為Southern印跡技術。RNA印跡技術正好與DNA相對應，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質印跡技術則被稱為westernblotting。Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在進樣前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2’-羥基基團。RNA變性后有利于在轉印過程中與硝酸纖維素膜結合，它同樣可在高鹽中進行轉印，但在烘烤前與膜結合得并不牢固，所以在轉印后不能用低鹽緩沖液洗膜，否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB，因它為影響RNA與硝酸纖維素膜的結合，為測定片段大小，可在同一塊膠上加標記物一同電泳，之后將標記物膠切下，上色、照像。樣品膠則進行Northern轉印，標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/mlEB的0.1mol/L醋酸銨中10min，在水中就可脫色。在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。從瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時，甲基氫氧化汞是一種強力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應避免RNase的污染。

（5）組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）

簡稱原位雜交，指組織或細胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細菌釋出DNA，然后進行雜交。而原位雜交是經適當處理后，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補序列在胞內的空間位置，這一點具有重要的生物學和病理學意義。例如，對致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示特定的序列的位置；對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質內的功能排布；與細胞RNA的雜交可分析任何一種RNA在細胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術。

用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針，探針的長度通常以100～400nt為宜，過長則雜交效率減低。zui近研究結果表明，寡核苷酸探針（16～30nt）能自由出入細菌和組織細胞壁，雜交效率明顯高于長探針。因此，寡核苷酸探針和不對稱PCR標記的小DNA探針或體外轉錄標記的RNA探針是組織原位雜交的優選探針。