PCR法DNA探針標記試劑盒操作使用說明書

【資料簡介】

原理及特點    PCR標記的原理是用帶標記的dNTP進行PCR，zui后得到的PCR產物將帶有標記，可以直接用于雜交試驗。其原理示意圖如下：
PCR法制備DNA探針示意圖
 
本產品是在上述原理的基礎上開發，它具有下列特點：
1.    一站式，本試劑盒提供經過優化的試劑，不需要用戶自己摸索。
2.    足夠10次50 uL體系的常規PCR（用于制備標記反應的模板和設置對照反應）和5次50 uL體系的標記反應。
3.    一次標記可以得到ug級的雙鏈DNA探針或約700ng的單鏈DNA探針，足夠多次雜交實驗用。
4.    既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。
5.    90604A需自備含標記核苷酸的dNTP， 90604B和90604C分別含*和地高辛標記的底物。自備的標記包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
6.    本產品得到的探針參入率一般為4-5%（每100個核苷酸中有4-5個將帶有非同位素標記），有效降低了空間阻礙，檢測效果*。
7.    可以用于Southern 和Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點印跡雜交等分析。
規格及成分    成 份    編 號    5次塑料盒包裝
2×標記PCR Mix    90604A    500 uL
dNTP，2 mM each    121128    50 uL
含Biotin-11-dUTP的 dNTP     90604B    25 uL（僅B有）
含DIG-11-dUTP的dNTP    90604C    25 uL（僅C有）
超純水    100935    1 mL
使用手冊    1份
注：標記PCR Mix不含dNTP。
運輸及保存    低溫運輸，-20℃保存，有效期一年
自備試劑    DNA模板和模板專一性引物。
使用方法    一：準備工作
1.    按常規的方法設計PCR引物，使探針長度在400-800bp之間。過短則標記參入少，探針雜交信號強度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強。
2.    根據PCR引物優化PCR條件。
3.    由于標記的dNTP比較珍貴，所以本試劑盒不推薦以基因組DNA或其他復雜DNA為模板直接進行PCR標記，而是建議采取下述的兩步法標記來提高成功率，即先制備非標記PCR產物，再以之為模板制備標記的PCR產物。
二：非標記PCR產物的制備
4.    設置50 uL PCR的反應體系：
成份    用量
2×標記PCR Mix    25 uL
dNTP，2mM each    5 uL
自備的探針引物一（10pmol/uL）    1 uL（10 uM）
自備的探針引物二（10pmol/uL）    1 uL（10 uM）
自備的模板DNA    1 ug基因組DNA或1ng質粒DNA
超純水    補到50 uL
5.    按已經優化的PCR參數進行PCR。
6.    電泳檢測和膠回收所需的PCR產物，并定量。用10 pmol引物一般能得到1ug左右的PCR產物（具體取決于PCR產物的長度）。注意：采取膠回收而不是PCR回收以避免殘留引物干擾后續的標記PCR。
三：標記PCR反應（做一個不加標記的對照用于定量）
說明：在設置下面反應時，如果加一種引物，就得到單鏈標記的PCR產物；如果加兩種引物，則得到雙鏈標記的PCR產物。由于雙鏈PCR探針在雜交前雖然要變性成單鏈后使用，但雜交時變性的雙鏈彼此還會復性，這種復性會與探針-靶DNA雜交反應相競爭，降低雜交效率，因此強烈推薦使用單鏈標記的DNA探針。
成份    樣品    對照
2×標記PCR Mix    25 uL    25 uL
含Biotin-11-dUTP的 dNTP或
含DIG-11-dUTP的dNTP或
自備的含其他標記dUTP的dNTP    5 uL    不加
dNTP，2mM    不加    5 uL
雙鏈標記：探針引物一和引物二
單鏈標記：探針引物一或引物二    每種50 pmol
一種50 pmol    每種50 pmol
一種50 pmol
上步膠純化所得PCR產物
（單鏈標記可用100ng）    10 ng    10 ng
超純水    補到50 uL    補到50 uL
注意：本試劑盒提供的dNTP混合物中，標記底物與非標記底物的比例已經進過優化，如果自備標記dUTP，其與dTTP的*比例需要優化，標記不同，比例不同。對DIG-11-dUTP，*比例1：3；對BrdUTP，*比例為1：1。
7.    按第5步的PCR參數進行標記PCR，但需要進行下列修改：一是循環數增加到35-55個循環。由于模板為純化后的PCR產物，探針對擴增長度完整性要求不高（長度不均的探針由于能形成網絡結構，效果反而更好），所以可以增加循環數；二是延伸時間增加15秒，因為標記dUTP參入到DNA的速度比常規的dTTP慢；三是降低復性溫度5-7℃，因為標記核苷酸參入到DNA后，新模板的Tm值將降低。
8.    標記探針的定量：取標記反應和對照反應的產物1-5 uL，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的DNA marker一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標記反應的PCR產物中額外帶有非同位素的配體（*，地高辛等）、因此其泳動速度將慢于非標記PCR產物（但同位素標記不能用此法）。是下圖是一個典型的雙鏈PCR產物電泳結果圖：
 
標記的DNA（右）與未標記的DNA（左）電泳比較
注意：如果擴增的是單鏈DNA探針，其結合EB的能力遠低于雙鏈DNA（EB是嵌合到雙鏈堿基對之間的，而單鏈DNA沒有堿基對，只有一些局部區域折疊形成的有限雙鏈區，因此能結合的EB很少），因此EB染色的強弱不能準確反應DNA的濃度，可以采用銀染定量（跟marker比較）。一般100ng模板按上述條件經過單鏈PCR擴增可得到700ng左右探針。
9.    剩余的PCR標記產物可以不經過純化，直接加入（對單鏈PCR探針）雜或加熱變性并急冷后加入（對雙鏈PCR探針）到雜交液中使用。如果暫時不用請放-20℃長期保存。如果需要純化，請使用乙酸銨/乙醇沉淀法。
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