條件性基因敲除小鼠模型實驗技巧

【資料簡介】

小鼠和大鼠可謂是生命科學實驗室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可謂是“生命科學的好幫手”。很多人可能想自己設計或是了解條件性基因敲除小鼠，在此做個小結，供大家參考。

條件性基因敲除小鼠的設計利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。它們都是位點特異性重組酶系統。這里以Cre/LoxP系統為例。比如在待敲除的一段目標DNA序列的兩端各放置一個loxP序列，得到flox（flanked by loxP）小鼠。將flox小鼠與帶有細胞特異性表達Cre的小鼠交配繁殖，以獲得在特定細胞里把目標基因敲除掉的小鼠，即條件性基因敲除小鼠。此外，若與控制Cre表達的其他誘導系統（比如CreERT2）相結合，還可以對某一基因同時實現時空兩方面的調控。

Cre/loxP系統來源于噬菌體，可以介導位點特異的DNA重組。該系統含有兩個組成成分：一個是一段長34bp的DNA序列（LoxP序列），含有兩個13 bp的反向重復序列和一個8 bp的核心序列。 LoxP的方向由中間這8個堿基決定。這段LoxP序列是Cre重組酶識別的位點。 令一個組成部分是Cre重組酶。它是由噬菌體編碼的一種由343個氨基酸組成的蛋白。Cre可以介導兩個LoxP位點的重組，從而引起兩個LoxP之間DNA序列的缺失。如果將Cre重組酶cDNA通過基因工程的手段置于組織或細胞特異性啟動子之下，可以得到Cre組織/細胞特異性表達的Cre小鼠，也叫Cre工具小鼠。 跟Flox小鼠交配之后，可以得到條件性基因敲除小鼠。

所謂Flox小鼠是指在某個基因的某個外顯子兩側各放一個LoxP序列。這段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。這種Flox小鼠一般要通過設計構建打靶載體、胚胎干細胞重組、囊胚顯微注射、和嵌合體小鼠傳代來獲得。這種小鼠跟Cre工具小鼠交配，由于Cre的表達，介導兩個LoxP位點序列的重組，從而敲除兩個LoxP之間的序列。由于不同Cre工具小鼠的Cre表達有組織/細胞特異性，就可以達到在不同組織、細胞里特異性敲除目的基因的目標。比如上皮細胞、胸腺細胞、T細胞、B細胞、心肌細胞、腸道、肺臟等。

那如何設計條件性基因敲除小鼠呢?這里所說的設計主要是Flox小鼠的設計。所謂條件性敲除，是說除了特定細胞外，其它細胞里面沒有任何的基因表達異常。一般情況下，不要在*個外顯子前面放置LoxP序列。因為*個外顯子前面一般是啟動子。放置LoxP序列有可能會破壞或改變啟動子活性。條件性敲除一般是敲掉zui早引起移碼突變的外顯子。這樣的話，不要敲除有起始密碼子ATG的外顯子。否則的話，基因可能會利用ORF內的ATG編碼一個缺少部分N端序列的蛋白，這個蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能。在選擇要敲除的外顯子的時候（各放一個LoxP在一個外顯子的兩側），該外顯子的堿基數目不能是3N，否則新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能產生移碼突變。會產生一個與野生蛋白相比少了一段中間序列的新蛋白。如果一個外顯子的堿基數目是3N+1或3N+2，敲除這個外顯子之后會產生移碼突變，就可以達到基因敲除的目的。篩選要敲除（Floxed）的外顯子的時候，一般是從zui上游的外顯子開始篩選適合敲除的外顯子。需要注意的是，一般的DNA分析軟件不能確定內含子和外顯子的邊界，需要仔細核對。95%以上的邊界遵循gt/ag邊界原則。也可以在Ensembl上查一個基因的外顯子和內含子。這個上的結果絕大部分是正確的。但也需要仔細核對。畢竟基因敲除小鼠研發是一個時間比較長的過程，需要特別小心。前期做多少的考慮都不嫌多。這些原則只是對一般課題的考慮。特殊情況需要特殊處理。比如，如果只是想敲除一個基因的某個特定domain，或是如果一個基因有一個很大的外顯子，這個時候即使這個外顯子的堿基數目是3N，也可以對其進行敲除。