小鼠細小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒說明書

【資料簡介】

小鼠細小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：小鼠細小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒

【包裝規(guī)格】50 次/盒

【產(chǎn)品及特點】

本公司開發(fā)小鼠細小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列

特點：

1.即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2.引物根據(jù)小鼠細小病毒專一區(qū)設(shè)計，特異性高。

3.熒光定量 PCR 檢測，比常規(guī) PCR 更加靈敏。

4.一管式閉管操作，降低了交叉污染。

5.本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。

6.本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

【規(guī)格及成分】

成分 編號 塑料盒包裝

2×qPCR MagicMix 90408 500 μL （棕色管）

熒光 PCR 專用模板稀釋液 180701 1 mL （黃蓋）

小鼠細小病毒染料法 qPCR 引物混

合液

4yw-8195 100 μL （白蓋）

小鼠細小病毒染料法 qPCR 陽性對

照(1×10E8 拷貝/μL)

60908-81950

pc

50 μL （黃蓋）

使用手冊 LZ4W-8195 1 份

【運輸及保存】

低溫運輸、 -20℃保存， 有效期一年。

【自備試劑】

DNA 模板、 超純水、 10×ROX （根據(jù)機型決定，具體見使用方法） 。

【使用方法】

一、 稀釋 PCR 陽性對照 （以 10E2- 10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀

釋度為例）

1.注意： 由于陽性對照濃度非常高， 因此下列稀釋操作一定要在獨立的

區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分） 。

2.標記 6 個離心管，分別為 7， 6， 5， 4， 3， 2。

3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯

槍頭，下同） 。

4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1

分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上

步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放

冰上待用。

6.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5

號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。 放冰上

待用。

7.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。 放冰上待用。

二、 樣品 DNA 的制備

8.如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制

備陽性對照），一個是 NC （樣品制備陰性對照）。 可以用 10μL PCR 陽

性對照的 10000 倍稀釋的 （稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL， 10μL

相當于 10 萬拷貝，可以將 10μL 原液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，

充分混勻，此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此稀釋液加入到 990μL 自

備 TE 溶液中，充分混勻，此為 10000 倍稀釋液） 再加上一定量的水作

為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所

用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對照。制備所得成為樣品

DNA。

9.用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提

取試劑盒兼容。

三、 設(shè)置 qPCR 反應(yīng) （20 μL 體系，在樣品制備室進行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標記 N+9 個 PCR 管， 其中

N+2 個用于上 步得到的 N+2 個樣品， 1 個用于 PCR 陰性對照， 6 個

用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標記 N+4 個

PCR 管， 其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品， 1 個用于 PCR 陰

性對照（用水做模板）， 1 個用于 PCR 陽性對照（用 第 4 號陽性對照

稀釋液， 濃度為 10E4 拷貝/μL） 。下面只描述定量分析的步驟，定性

分析只是把 6 個標曲反應(yīng)縮減成 1 個， 其余不變。

11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性

對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋

子儲存好后最后加） ：

成分

樣品管

N+2 個

PCR 陰性

對照管

PCR 陽性

對照管

（2-7 管）

2×qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL

小鼠細小病毒染料法 qPCR 引物混

合液

2 μL 2 μL 各 2 μL

自備 10×ROX (見注) 2 μL 2 μL 各 2 μL

N+2 待測樣品 cDNA 模板 6 μL - - 自備超純水 - 6 - 第 7 步所得 PCR 陽性對照 稀釋

液（2-7 號） - - 各 6μL （2

號樣到

2 號管，3

號樣到 3

號管 …）

注:僅 ABI7500、 7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照， 其他熒

光 PCR 儀 器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、

RotorGene3000、 RotorGene 6000 和 LightCycler480） 不需要使用

ROX， 則用水替代。

12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR （具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀

器不同而自行優(yōu)化）。

過程 溫度 時間

預(yù)變性 95℃ 5 min

PCR 反應(yīng)

（40 個循環(huán)）

95℃ 15 sec

60℃ 1 min，（采集 SYBR 通道的熒光信號）

按儀器預(yù)設(shè)程序進行熔解曲線分析

四、 數(shù)據(jù)處理

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測， 則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸， 以

Ct 值為縱軸， 繪制標準曲線。 再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出

樣品 cDNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須

大于或等于 35。 陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線， Ct 值應(yīng)

該小于或等于 30。對待測樣品， 如果其 Ct 大于或等于 35 則為陰性， 如

果小于或等于 30 則為 陽性。如果在 30-35 之間，可結(jié)合熔解曲線判斷，若

樣品的熔解溫度與陽性對照相同，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。 【關(guān)聯(lián)產(chǎn)品】

小鼠細小病毒探針法熒光定量 PCR 試劑盒