半胱氨酸（cysteine, Cys）含量測(cè)定試劑盒

【資料簡介】

測(cè)定意義：

蛋白質(zhì)含有三種含硫氨基酸：甲硫氨酸、胱氨酸和Cys。其中，Cys是一種含有巰基的含硫氨基酸，從甲硫氨酸轉(zhuǎn)化而來，并且可與胱氨酸互相轉(zhuǎn)化。Cys參與蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，經(jīng)常是蛋白質(zhì)活性中心的組成部分，還可以為其它生理生化反應(yīng)提供巰基。此外，Cys大量積聚在皮膚和粘膜表面，在角蛋白生成中維持重要的巰基酶的活性，并且補(bǔ)充巰基，以維持皮膚的正常代謝，調(diào)節(jié)表皮下層的色素細(xì)胞生成的底層黑色素。具有美白、解毒、改善炎癥和過敏性皮膚等作用。

測(cè)定原理：

Cys還原磷鎢酸生成鎢藍(lán)，在600nm處有吸收峰；通過600nm吸光度，計(jì)算Cys含量。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、磷酸和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。用前1天，向試劑三中加2.5mL蒸餾水充分溶解，再加磷酸0.625mL，混勻后蓋緊（防止水分散失）沸水浴2h；冷卻后加10mL蒸餾水，4℃可保存2周。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1瓶，1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

半胱氨酸提取：

1. 液體樣品中半胱氨酸提取：取0.1mL液體樣品，加試劑一0.9mL，充分混勻，11000 rpm 4℃離心10min，取上清液，待測(cè)。
2. 組織中半胱氨酸提取：稱取約0.1 g組織，加入試劑一1 mL，冰上充分研磨，11000 rpm 4℃離心10 min，取上清液待測(cè)。

測(cè)定操作：

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長到600 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入20μL蒸餾水，100μL試劑二，100μL試劑三，混勻后室溫靜置15 min，于600nm處測(cè)定吸光值，記為A空白管。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取1mL玻璃比色皿，加入20μL標(biāo)準(zhǔn)液，100μL試劑二，100μL試劑三，混勻后室溫靜置15 min，于600nm處測(cè)定吸光值，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測(cè)定管：取1mL玻璃比色皿，加入20μL上清液，100μL試劑二，100μL試劑三，混勻后室溫靜置15 min，于600nm處測(cè)定吸光值，記為A測(cè)定管。

樣品中半胱氨酸含量計(jì)算：

1. 按液體樣品的體積計(jì)算

半胱氨酸含量（μmol/mL）

=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白)]×（V樣總÷V樣）

=10×(A測(cè)定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白)

C標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，1 μmol/mL；V標(biāo)準(zhǔn)品：反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.1 mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積，0.1 mL；V樣總：樣品提取液，1mL。

2. 按鮮重計(jì)算

半胱氨酸含量（μmol/g FW）

=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白)]×（V樣總÷V樣）÷W

=1×(A測(cè)定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白) ÷W

W：樣品質(zhì)量，g。