提高PCR的忠實性

【資料簡介】

帶有校正功能的酶 

包括克隆和效率分析，PCR產(chǎn)物表達或定點突變在內(nèi)的PCR應(yīng)用都需要高忠實性的PCR。Taq dna聚合酶被看做是低忠實性的聚合酶，因為其缺少3’到5’外切核酸酶（校正）活性。

使用帶有3’到5’外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定聚合酶可以提高忠實性。 

但是這些聚合酶的產(chǎn)量比taq DNA聚合酶低。Platinum Pfx DNA聚合酶明顯比Taq DNA聚合酶忠實性高，而且?guī)в蠵latinum產(chǎn)品產(chǎn)量和特異性高的優(yōu)點（圖25）。 

使用人thrombospondin的1.1kb片段的探針對基因組DNA（泳道1到6分別為100，50，10，5，1和0ng）擴增35個循環(huán)。A組，使用1單位Platinum Pfx Taq DNA聚合酶，在室溫配制反應(yīng)液。B組，使用2.5單PfuTurbo™ DNA聚合酶，在冰上配制反應(yīng)液。C組，使用1單位Taq DNA聚合酶，在冰上配制反應(yīng)液。 

酶混合物 

將Taq DNA聚合酶同帶有3’到5’外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨Taq DNA聚合酶高的忠實性，并可以得到高產(chǎn)量及擴增長模板。Gibco BRL高保真酶混合物，Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity忠實性是單獨Taq DNA聚合酶的6倍，并可以zui高擴增到12kb。 

其他參數(shù) 
除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會降低忠實性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加度。如果四種核苷的濃度不同，忠實性會受影響。進行較少的PCR循環(huán)也會有助于增加忠實性，因為增加循環(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長度就會增加突變可能性。