DNA末端修飾原理

【資料簡介】

Chapter 4 replication
DNA replication
DNA damage and repair
Reverse transcription
RNA replication
DNA復制的基本特點
半保留復制(self-conservative replication)
復制子(replicon)
半保留復制
1958年,Meselson 和Stahl用實驗證實了DNA的半保留復制.
步驟:
用普通培養基(14N)培養15N標記的大腸桿菌.用CsCl密度梯度離心法分析DNA.
加熱子一代DNA分子.
復制子(replicon)
復制子:基因組中能單獨進行復制的單位.
每個起始點到終止點的區域為一個復制子.
起始點(origin of replication ,ori):原核生物DNA分子中只有一個,長度 200bp左右.大腸桿菌ori C有245 bp.真核生物有多個復制起始點.
終點(ter):D,A,C,B(23bp共有序列)Tus(terminator utilization substance)識別終止序列.
復制的方向:單向或雙向 
原核生物DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol)
1958年Kornberg首先從大腸桿菌提取
DNA polⅠ:聚合作用:5` → 3`
3` → 5`外切酶活性:校對功能
5` → 3`外切酶活性:引物切除,損傷修復
主要功能是切除引物,填補岡崎片段產生的空隙及DNA損傷的修復
DNA polⅠ是單一肽鏈的大分子,分子量為109kD,二級結構以α-螺旋為主.
用特異的蛋白酶處理,可把DNA polⅠ水解為兩個片段,即在F,G螺旋之間發生斷裂.
小片段:323個氨基酸殘基, 5` → 3`外切酶活性
大片段或稱Klenow片段:604個氨基酸殘基,DNA聚合酶活性和3` → 5`外切酶活性
DNA pol Ⅱ:5` → 3`聚合酶活性及3` → 5`外切核酸酶活性.
DNA polⅢ: 由10 個亞基組成,分別為α,ε,θ,τ,δ,δ`,β,κ及ψ.是原核生物體內真正起復制作用的酶.
α亞基: 5` → 3`聚合酶活性
ε亞基:3` → 5`外切酶,校對和編輯
θ為裝配必須
大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ
真核生物DNA聚合酶
α,β,γ及δ四種,都有5`→ 3`聚合功能.α及δ參與核DNA復制;
α:鏈合成的引發,δ:鏈的延長
polδ;切除引物后填補空隙
β:外切核酸酶 
γ:線粒體DNA復制
其它環狀DNA分子的復制
1,θ復制:首先由J.Carins 從大腸桿菌中觀察到,又稱為 Carins復制.
2,滾環復制(rolling circle replication)
3,D環復制(D loop replication):線粒體DNA復制
端粒與端粒酶(omerase)
omere:真核生物線性染色體3末端的一種特殊結構.核苷酸重復序列富含G,和端粒結合蛋白組成核蛋白復合物.人的DNA端粒含有TTAGGG重復序列,長度5~15kb.
作用:保護染色體末端免于化學修飾或核酸酶降解;解決染色體復制時末端丟失問題.

omerase: 由RNA和蛋白質組成的酶.兼有模板和逆轉錄酶兩方面的作用.
1995年,Junli Feng等克隆了人類端粒酶RNA基因,長約450個堿基的RNA序列中有一段長11個核苷酸的區域(5-CUAACCCUAAC-3)與人的端粒序列(TTAGGG)n互補.
端粒酶蛋白質的分離:四膜蟲端粒酶兩個多肽成分p80和p95.
端粒與衰老
實驗:在無端粒酶活性的成纖維細胞中表達端粒酶時,端粒的縮短和細胞的衰老都受到抑制.
結論:細胞的衰老是由端粒驅動的.
體外培養的細胞端粒的長度隨細胞逐代相傳而縮短,丟失到一定程度便失去對染色體的保護作用.細胞隨之發生衰老和死亡.
可把端粒看成一面鐘,端粒的長度是鐘上的刻度,記載了細胞分裂的次數,稱為"端粒鐘",或有絲分裂鐘 或"生命的時鐘",可通過測定端粒的長度預測細胞的壽命.
胚胎細胞和生殖細胞端粒的長度并不隨細胞分裂次數的增加而縮短,具有無限的分裂能力,原因在于端粒酶的存在.